【摘要】： 目的：大型頜骨缺損歷來是臨床修復(fù)的難點，盡管可供選擇的治 療手段很多，但很少有一種方法能比較理想地解決修復(fù)問題，獲得令人滿 意的效果。骨組織工程的提出為解決這一難題提供了新的途徑。成骨細胞 作為骨組織工程的種子細胞，它的獲取和培養(yǎng)是組織工程中最基礎(chǔ)和最為 重要的環(huán)節(jié)。在成骨細胞多種來源中，骨髓來源最為優(yōu)越。骨髓來源的成 骨細胞由骨髓內(nèi)骨祖細胞分化而來，但骨祖細胞數(shù)量有限，增殖較慢，難 以適應(yīng)種子細胞庫大量細胞的需要。本實驗采用兔骨髓基質(zhì)細胞作為骨組 織工程種子細胞的來源篩選培養(yǎng)兔成骨細胞，并觀察其生物學(xué)特性，為從 骨髓途徑獲取篩選種子細胞并應(yīng)用于骨組織工程修復(fù)頜骨缺損提供一定的 實驗依據(jù)；并探討胰島素樣生長因子Ⅱ（insulin-like growth factor Ⅱ，IGF Ⅱ）、堿性成纖維細胞生長因子（basic fibroblast growth factor，b-FGF）、轉(zhuǎn)化 生長因子-β（transforming growth factor β，TGF-β）這3種生長因子單獨及交互 聯(lián)合應(yīng)用后對成骨細胞增殖的影響，希望能選擇一種合適的促進成骨細胞 增殖的方法，為成骨細胞適應(yīng)骨組織工程種子細胞庫的大量需要提供一定 的實驗基礎(chǔ)。 方法：抽取日本大耳白兔骨髓液經(jīng)離心后得骨髓單個核細胞，經(jīng) 兔成骨細胞的培養(yǎng)及生長因子對其體外增殖影響的實驗研究 PBS液洗滌后以 IX 10fynd的細胞濃度進行培養(yǎng)，2周后得到貼壁生長的單 層細胞。隨后進入傳代培養(yǎng)，通過倒置顯微鏡、HE染色、掃描電鏡、透 射電鏡、堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）染色、I型膠原免疫組化染 色、鈣染色等手段對獲得的細胞進行生物學(xué)特性研究。然后將細胞與載體 材料聚乳酸（PLA）、膨體聚四氟乙烯（OPTFO復(fù)合培養(yǎng)1周后回植自體兔肌 肉內(nèi)，4周、巴周后植人部位取材，組織學(xué)方法觀察其體內(nèi)成骨能力。并采 用體外培養(yǎng)的第5代成骨細胞，用鷹陛藍比色法，觀察胰島素樣生長因子 11、堿性成纖維細胞生長因于、轉(zhuǎn)化生長因子·p這三種生長因于單獨及交 互聯(lián)合應(yīng)用后對成骨細胞體外增殖的影響。 結(jié)果：在形態(tài)學(xué)上，本實驗所培養(yǎng)的細胞能夠貼壁，呈多種形態(tài)， 有粗細不均的胞漿突起，并且呈集落樣生長，可相互重疊成復(fù)層生長，并 形成細胞結(jié)節(jié)。電鏡下可見典型的蛋白質(zhì)合成結(jié)構(gòu)；胞漿富含線粒體、粗 面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體，表明合成分泌功能旺盛，符合成骨細胞的形態(tài)及生 長特性。在生化和”組織化學(xué)上，培養(yǎng)細胞富含ALP活性，主要合成1型膠 原，并且在條件培養(yǎng)基中可以鈣化（Von Kossa染色陽性）。符合成骨細胞 鑒定的標(biāo)準(zhǔn)。且細胞經(jīng)連續(xù)傳代，形態(tài)與功能不變。成骨細胞經(jīng)體外增殖， 與載體復(fù)合培養(yǎng)后生長良好。植入體內(nèi)后早期（4周時）形成的骨基質(zhì)結(jié) 構(gòu)疏松，。周圍仍有較多成骨細胞，晚期（8周時）則可見形成的骨樣組織 結(jié)構(gòu)致密，內(nèi)有骨細胞位于骨陷窩中，與典型的骨組織結(jié)構(gòu)基本相似。 在相同培養(yǎng)條件下，三種生長因子均能促進成骨細胞增殖，IGF．H、 bFGF這兩種生長因于在0．l－10．ong／thl濃度范圍內(nèi)與兔成骨細胞增殖呈劑 量·效應(yīng)關(guān)系，并以10．onglml這個濃度促增殖作用最為顯著，濃度超過該 值后，促增殖作用反而下降。TGF－D在0。olghl時促增殖作用最為顯著， 隨著濃度增高，作用下降。選擇較佳效應(yīng)濃度的3種生長因于與兔成骨細 胞培養(yǎng) 1天后，除 10．0 il bFGF外，其余促增殖作用均不顯著，3天后 第2頁 兔成骨細胞的用養(yǎng)及生長因于對其體外增殖影響的實驗研究 出現(xiàn)促增殖差異，5天后，生長因子促進兔成骨細胞增殖作用達到最大，7 天后，作用減弱。三種生長因子交互作用時，對兔成骨細胞的增殖有協(xié)同 作用，均促進兔成骨細胞的增殖，并以生長因于 bFGF＋GF·11與 bFGF＋IGF·H可GF小聯(lián)合作用效果較為顯若。 結(jié)論： 二．兔骨髓基質(zhì)細胞經(jīng)體外培養(yǎng)后生長活躍，具有與成骨細胞相似的形態(tài) 特征及生長特點；具有較強的ALP活性，能分泌I型膠原，能體外鈣化； 細胞一載體復(fù)合物植入體內(nèi)八周后能形成骨組織。表明：我們從兔骨髓中 篩選培養(yǎng)成功的細胞是兔成骨細胞，從骨髓中獲取成骨細胞的方法是可行 的。 2．三種生長因于均能促進兔骨髓成骨細胞的增殖，生長因子促增殖作用 有劑量依賴性和時間依賴性，三種生長因子交互作用時有協(xié)同作用，提示 生長因子在體外可促進兔成骨細胞增殖，可作為在較短時間快速獲得骨組 織工程種子細胞一成骨細胞的一種有效的途徑。
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2001
【分類號】：R329.2

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本文編號：2798298