發(fā)布時(shí)間：2020-08-17 14:07

【摘要】：目的:我國流行的腎綜合征出血熱主要由漢坦病毒屬的漢城型病毒和漢灘型病毒引起,多屬漢灘型為主或漢城型為主的混合型疫區(qū),僅接種單一型別的漢坦病毒疫苗,不能完全預(yù)防其他型病毒的交叉感染。因此,迫切需要研制和開發(fā)雙價(jià)或多價(jià)漢坦病毒疫苗。1、本課題的第一部分利用含有卡那霉素抗性基因的真核質(zhì)粒表達(dá)載體pEGFP,通過構(gòu)建同時(shí)含有漢城型病毒Z37株完整的M片段和漢灘型病毒國際標(biāo)準(zhǔn)株76-118株S基因中編碼核蛋白主要抗原表位約0.7kb片段的重組核酸疫苗pEGFP-M-S,希望能夠同時(shí)充分發(fā)揮有保護(hù)性抗原作用的M片段編碼的糖蛋白、S基因編碼的核蛋白的保護(hù)性免疫作用,為利用含有兩型漢坦病毒抗原性片段的重組DNA疫苗進(jìn)行基因免疫的研究奠定物質(zhì)基礎(chǔ),以期在疫區(qū)能夠同時(shí)控制兩型漢坦病毒的感染,為研制漢坦病毒的DNA疫苗奠定基礎(chǔ)。 2、本課題的第二部分首先用不同劑量的重組質(zhì)粒pEGFP-M-S以肌肉注射的方式對(duì)BALB/c小鼠進(jìn)行基因免疫,檢測(cè)免疫小鼠的特異性的體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答狀況。然后對(duì)鼻腔滴入免疫方式和肌肉注射免疫方式對(duì)免疫小鼠產(chǎn)生的特異性的體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答的狀況進(jìn)行比較研究。 方法:1、以質(zhì)粒pUCM(含有漢城型病毒Z37株M片段1-1678bp)為模板,PCR擴(kuò)增47-1666bp的產(chǎn)物,裝入質(zhì)粒pcDNA3.1,記為重組質(zhì)粒M1;以質(zhì)粒pGEM(含有漢城型病毒Z37株M片段1601-3638bp)為模板,PCR擴(kuò)增1661-3445bp的產(chǎn)物,裝入質(zhì)粒pcDNA3.1,記為重組質(zhì)粒M2;將質(zhì)粒M1和M2分別用BamH Ⅰ和Kpn Ⅰ雙酶切,分別回收7.1kb的大片段和1.8kb的小片段,連接起來,記為重組質(zhì)粒pcDNA3.1-M。以質(zhì)粒PJSA1175-HVS(含有漢灘病毒76-118株S基因)為模板,PCR擴(kuò)增40-795bp的產(chǎn)物,裝入質(zhì)粒pEGFP,記為重組質(zhì)粒pEGFP-HTNV-S0.7。用Xho Ⅰ和Pst Ⅰ雙酶切pcDNA3.1-M,回收3.4kb的小片段,與經(jīng)同樣雙酶切并回收5.4kb大片段的pEGFP-HTNV-S0.7用酶切位點(diǎn)連接,構(gòu)成4.1kb的重組基因,記為pEGFP-M-S,并轉(zhuǎn)
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2005
【分類號(hào)】：R392
【圖文】：

以質(zhì)粒pUCM為模板，用分別含有勸01的上游引物Pl和B田舊Hl的下游引物P2進(jìn)行PCR擴(kuò)增、割膠回收，與質(zhì)粒PcDNA3.1同時(shí)進(jìn)行眾01和BamHI雙酶切、低溫連接、轉(zhuǎn)化，得到若干個(gè)轉(zhuǎn)化子的PCR鑒定結(jié)果見圖1，顯示約1.6kb大小的單一條帶，與預(yù)期大小相符。以質(zhì)粒pGEM為模板，用分別含有B出的Hl的上游引物P3和KPnl及Pstl的下游引物P4進(jìn)行PCR擴(kuò)增、割膠回收，與質(zhì)粒PcDNA3.1同時(shí)進(jìn)行B田叮Hl和KPnl雙酶切、低溫連接、轉(zhuǎn)化，得到若干個(gè)轉(zhuǎn)化子在序列的下游同時(shí)含有Pstl酶切位點(diǎn)。其PCR鑒定結(jié)果見圖2，顯示約1.skb大小的的單一條帶，與預(yù)期大小相符。

下游引物P4進(jìn)行PCR擴(kuò)增、割膠回收，與質(zhì)粒PcDNA3.1同時(shí)進(jìn)行B田叮Hl和KPnl雙酶切、低溫連接、轉(zhuǎn)化，得到若干個(gè)轉(zhuǎn)化子在序列的下游同時(shí)含有Pstl酶切位點(diǎn)。其PCR鑒定結(jié)果見圖2，顯示約1.skb大小的的單一條帶，與預(yù)期大小相符。

圖3.重組質(zhì)粒Ml、MZ的酶切鑒定MZ;3.質(zhì)粒penN^3.1一A卜);4，5.重組質(zhì)粒M2用BamHI和Kpnl的PCR產(chǎn)物;7.重組質(zhì)粒Mi用xhol和BamHI雙酶切;8.重組質(zhì)粒產(chǎn)物3.ldentifieationofereombinnatPlasmidsMInadMZbyerstrietionenZymesdLnael，2:ereombinnatPlasmidMZLnae3:PlasmidPeDNA3.l一A(一)nae4，5:Restrietionen習(xí)mesdigestofreeombinnatPlasmidMZbyBamHLane6:PCRProduetofreeombinnatPlasmidMZnae7:Restrietionen刃mesdigestofreeombinnatPlasmidMlbyXhoInadLnaes:PCRProduetsofreeombinnatPlasmidMI粒peDNA3.1一M的酶切鑒定盒抽提重組質(zhì)粒Ml和MZ，將質(zhì)粒Ml和MZ分別用BmaHI收約7.Ikb的大片段和1.ksb的小片段;或者用乃。I和BmaH.6kb的小片段和.73kb的大片段，分別將相應(yīng)回收的大、小片

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

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本文編號(hào)：2795425