【摘要】： 血管生成素-1(angiopoietin-1,Ang-1)是一種分泌型糖蛋白，可與酪氨酸激酶樣受體Tie2結(jié)合，使其磷酸化，在細胞中引發(fā)一系列化學反應(yīng)，從而發(fā)揮其細胞因子的功能。它在血管生成、創(chuàng)傷修復(fù)、腫瘤發(fā)生等很多生理病理過程中，都發(fā)揮了重要的作用。人血管生成素-1(hAng-1)全長為498個氨基酸，其氨基端為前體蛋白的信號肽區(qū)域；羧基端為纖維蛋白原樣結(jié)構(gòu)域，可與Tie2結(jié)合，是Ang-1生物學活性的決定部位；位于中部的區(qū)域富含卷曲螺旋，Ang-1分子通過這段結(jié)構(gòu)聚合形成多聚體。 本實驗首先用逆轉(zhuǎn)錄PCR從一名健康人骨髓中擴增出hAng-1基因，并將其克隆到pMD18-T Vector上，經(jīng)過序列測定證實，我們得到了正確的hAng-1基因。為表達hAng-1，構(gòu)建了pQE31Ang-1和B7Ang-1兩種表達質(zhì)粒，分別在大腸桿菌M15和CHO細胞中進行原核和真核表達。 在原核表達系統(tǒng)中，hAng-1以包涵體形式表達，用鎳柱親和層析對蛋白進行純化，透析復(fù)性后得到可溶的hAng-1。通過雞胚絨毛尿囊膜(chorioallantoic membrane，CAM)血管生長實驗證實，復(fù)性的hAng-1具有刺激血管生長的生物活性，2.5μg hAng-1即能有效刺激CAM血管生長。 大腸桿菌中表達的hAng-1蛋白經(jīng)純化后，免疫健康大白兔，獲得hAng-1多抗。hAng-1多抗經(jīng)ELISA檢測，滴度可達到1：1×10~6。用獲得的hAng-1兔多抗包被酶聯(lián)板，建立夾心ELISA實驗，用來檢測CHO細胞中的hAng-1表達量，可篩選出高表達的CHO細胞株。 在真核表達系統(tǒng)中，用氨甲喋呤(MTX)對表達hAng-1的CHO細胞進行加壓篩選，用飽和硫酸銨沉淀法對細胞培養(yǎng)液中的hAng-1進行濃縮，得到的蛋白用雞胚CAM血管生長實驗檢測生物活性，500ng CHO細胞表達的hAng-1能刺激CAM血管生長，其生物活性強于大腸桿菌表達的hAng-1。 通過hAng-1基因的克隆和在原核、真核細胞中的表達，我們得到了具有刺激CAM血管生長活性的重組hAng-1蛋白，并為進一步的研究工作打下了基礎(chǔ)。
【學位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2003
【分類號】：R346
【圖文】：

1基因序列進行同源性比較。實驗結(jié)果方法進行擴增，第一輪擴增出1700bp的片段，見圖1�；厥蘸螅c載體pMD18一T連的鑒定桿菌后，隨機挑取藍白斑篩選質(zhì)粒進行酶切鑒定，用BaxnHI2700bp、1700bp左右片段，bP

圖3pMD18Ang一1質(zhì)粒酶切鑒定M:DL15000DNA分子量標準一:BamHI酶切pMD18一T載體2:BamHI酶切pMD18Ang一1質(zhì)粒3:BamHI、sall酶切pMD18Ang一l

6pQE31Ang一1質(zhì)粒酶切鑒:DL15000DNA分子量標準:BamHI酶切pQE一31載體:BamHI酶切pQE3IAng一1:BamHI、Hindlll酶切pQE3M12345、少﨏了.一6JO了

本文編號：2791164