【摘要】：衣原體是專性細胞內(nèi)寄生的原核微生物，革蘭氏染色陰性，屬細菌范疇。衣原體引起的疾病相當廣泛：在發(fā)達國家衣原體是性傳播疾病的首位病原體，由它引起的非淋菌性尿道炎的發(fā)病率超過淋病，在性傳播疾病中己躍居首位；沙眼衣原體(C．t)感染眼部引起的沙眼曾肆虐全世界，至今仍是全球可預防性眼盲的首要原因；衣原體感染動物可導致牛、羊流產(chǎn)，母雞不能正常產(chǎn)卵，對養(yǎng)殖畜牧業(yè)造成很大危害；因此衣原體越來越成為人們關注的重要病原體。人們急切地期待衣原體疫苗的出現(xiàn)以控制衣原體的感染及蔓延，科技工作者在此領域已探索50余年，曾試驗過多種疫苗，如：滅活或減毒的衣原體疫苗、亞單位疫苗、樹突狀細胞疫苗等，但迄今尚無成熟疫苗問世。近年來DNA疫苗研究的快速發(fā)展給衣原體疫苗研制帶來新的希望，隨著分子生物學技術突飛猛進的發(fā)展，基因工程技術日臻完善，衣原體的生物構成及基因序列日益明朗，衣原體的DNA疫苗很有發(fā)展?jié)摿Α?DNA疫苗是運用基因工程技術，將編碼某種蛋白的外源基因與細菌質(zhì)粒構建的重組體直接免疫機體，轉(zhuǎn)染宿主細胞，使其表達保護性抗原，從而誘導機體產(chǎn)生特異性免疫的疫苗。 本實驗的目的是構建C．t主要外膜蛋白(MOMP)編碼基因ompA與pcDNA3質(zhì)粒的重組體ompA-pcDNA3，即C．t的DNA疫苗，希望能為C．tDNA疫苗的動物實驗研究提供材料。 實驗中選用的真核表達載體為pcDNA3質(zhì)粒，目的基因為C．t的MOMP編碼基因ompA，使用的C．t標本來源于性傳播疾病門診患者的尿道及宮頸分泌物。標本經(jīng)裂解處理后做為PCR擴增的模板，先用C．t種特異性引物擴增ompA基因，以此來篩選C．t陽性的臨床標本；PCR產(chǎn)物經(jīng)基因測序，確定C．t臨床標本的血清型；然后用帶限制性酶切位點的血清型特異性引物，PCR擴增此特定血清型的ompA基因；擴增的目的基因與載體經(jīng)酶切后，連接重組，轉(zhuǎn)化大腸桿菌；最后重組子經(jīng)抗生素平板篩選、PCR擴增篩選、酶切鑒定后，陽性重組子送測序公司，進行重組子的DNA序列測定。 實驗顯示：PCR擴增方法篩選C．t陽性的臨床標本，擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，擴增產(chǎn)物大小約1.2Kb，基因測序確定是C．t J血清型；PCR擴增 天津醫(yī)科大學碩士研究生論文 J型c.t MoMP編碼基因。mPA，擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，擴增產(chǎn)物片段 約1.OKb，與預期的1022bp一致;PCR擴增方法篩選重組子ompA一PcDNA3， 瓊脂糖凝膠電泳提示。mpA基因存在于PcDNA3質(zhì)粒中;雙酶切法篩選重組 子，酶切產(chǎn)生了5.4Kb和1 .oKb兩個片段，進一步證明omPA基因存在于 PcDNA3質(zhì)粒中;陽性重組子進行基因測序，證明插入PcDNA3載體中的墓 因片段與genebar水中J型C .t的 omPA基因序列一致。上述結果證明本實驗 成功構建了C.tJ型野生株。mpA基因的重組子ompA一peDNA3。
【學位授予單位】：天津醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2004
【分類號】：R346

【參考文獻】

相關期刊論文 前2條

1 周宗安,王延茹;基因疫苗的研究進展及臨床應用[J];東南國防醫(yī)藥;2003年02期

2 徐萬祥;沙眼衣原體的免疫清除機制及其疫苗制備[J];國外醫(yī)學(計劃生育分冊);2002年01期

本文編號：2781588