【摘要】：胃泌素(gastrin，GAS)是胃竇和十二指腸粘膜G細胞分泌的多肽類激素，主要生理作用是促進胃酸分泌和胃腸道粘膜的生長。研究顯示胃泌素是胃腸道腫瘤自泌性的生長因子，通過促進腫瘤細胞增殖、抑制凋亡、刺激浸潤以及和COX-2協(xié)同作用促進腫瘤生長。胃腸道腫瘤的抗胃泌素治療分為分泌抑制、受體拮抗、反義寡核苷酸抑制和抗胃泌素抗體治療。本課題的目的是開發(fā)一種基于腦膜炎球菌P64K蛋白的針對胃腸道腫瘤的胃泌素G17治療性疫曲。 我們選用人胃泌素G17N端9個氨基酸的B細胞表位(Glu-Gly-Pro-Trp-Leu-Glu-Glu-Glu-Glu)作為靶位，這個表位為胃泌素G17和甘氨酸延伸型胃泌素G17所特有，因而產(chǎn)生的抗胃泌素G17抗體不會與G34和CCK發(fā)生交叉反應。 P64K蛋白是來自于腦膜炎奈瑟氏球菌的一種外層膜蛋白。P64K蛋白作為載體蛋白可以幫助激活特異性體液免疫反應，近年來研究顯示P64K較傳統(tǒng)載體蛋白BSA、TT等有更好的免疫增強效果。我們選擇P64K蛋白，通過一段多肽交聯(lián)橋(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)與G17的B細胞表位交聯(lián)或者是構(gòu)建G17P64K融合蛋白來作為治療性疫苗，誘導機體產(chǎn)生抗胃泌素G17的抗體從而中和并清除內(nèi)分泌或者是源自腫瘤細胞自分泌的胃泌素，達到治療胃腸道腫瘤的目的。 我們從腦膜炎球菌中通過PCR克隆得到了P64K基因，構(gòu)建了P64K基因和G17P64K基因的pET28a表達載體，并在大腸桿菌中得到了高表達。目的蛋白經(jīng)硫酸銨沉淀、疏水層析、分子篩層析和陰離子層析得到純度超過90％的樣品。FMOC同相法化學合成多肽pyro-Glu-Gly-Pro-Trp-Leu-Glu-Glu-Glu-Glu-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Cys。MBS法交聯(lián)多肽與載體蛋白P64K及DT。制備抗胃泌素G17抗體試驗分為5組：合成多肽組，P64K蛋白組，DT多肽交聯(lián)組、P64K多肽交聯(lián)組和G17P64K融合蛋白組，分別加氟氏佐劑后免疫兔。經(jīng)兩次加強免疫后在DT多肽交聯(lián)組和P64K多肽交聯(lián)組動物血清中產(chǎn)生了高滴度的抗胃泌素G17抗體。細胞水平的體外活性評價試驗顯示抗體有較好的抑制腫瘤生長的生物學活性。
【學位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2004
【分類號】：R392.1
【圖文】：

G細胞轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生唯一的長度為0.7kb的胃泌素mRNA，在粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中翻譯生成101個氨基酸殘基的前胃泌素原(Preprogastrin)[3]。前胃泌素原經(jīng)不同方式的剪接產(chǎn)生多種結(jié)構(gòu)形式的胃泌素分子(見圖1)。前胃泌素原切除N端21個氨基酸長的信號膚，生成胃泌素原(progastrin)而被轉(zhuǎn)運到高爾基體。在高爾基體內(nèi)，胃泌素原第86位酪氨酸殘基(Tyr86)被硫酸化，第%位絲氨酸殘基(Ser96)被磷酸化修飾后，由高爾基體囊泡運輸?shù)紾細胞基底的早期內(nèi)分泌顆粒內(nèi)。運輸過程中，在胰蛋白酶、類梭基膚酶E的作用下，胃泌素原被降解生成甘氨酸延仲型胃泌素34。甘氨酸延伸型胃泌素34的N末端進一步被蛋白酶剪切加工，再經(jīng)谷氨酞環(huán)化修飾后進入內(nèi)分泌顆粒。在內(nèi)分泌顆粒內(nèi)

素G17治療性疫苗的研究第四章實驗結(jié)果的克隆因的克隆方法3.1.1內(nèi)引物1、2為上下游引物，以腦膜炎CR擴增尸64K基因，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析顯圖5所示條帶大小與預測結(jié)果一致。

方法311內(nèi)引物12為上下游引物，以腦膜炎CR擴增尸64K基因，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析顯圖5所示條帶大小與預測結(jié)果一致。圖5P64K基因擴增產(chǎn)物鑒定圖潛止密碼子的P64K’基因的克隆方法3.1.2內(nèi)引物1、3為上下游引物，PCR循環(huán)條電泳分析顯示條帶大小與預測結(jié)果一致(圖6)。

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