【摘要】：胃泌素(gastrin，GAS)是胃竇和十二指腸粘膜G細(xì)胞分泌的多肽類激素，主要生理作用是促進(jìn)胃酸分泌和胃腸道粘膜的生長(zhǎng)。研究顯示胃泌素是胃腸道腫瘤自泌性的生長(zhǎng)因子，通過促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、抑制凋亡、刺激浸潤(rùn)以及和COX-2協(xié)同作用促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)。胃腸道腫瘤的抗胃泌素治療分為分泌抑制、受體拮抗、反義寡核苷酸抑制和抗胃泌素抗體治療。本課題的目的是開發(fā)一種基于腦膜炎球菌P64K蛋白的針對(duì)胃腸道腫瘤的胃泌素G17治療性疫曲。 我們選用人胃泌素G17N端9個(gè)氨基酸的B細(xì)胞表位(Glu-Gly-Pro-Trp-Leu-Glu-Glu-Glu-Glu)作為靶位，這個(gè)表位為胃泌素G17和甘氨酸延伸型胃泌素G17所特有，因而產(chǎn)生的抗胃泌素G17抗體不會(huì)與G34和CCK發(fā)生交叉反應(yīng)。 P64K蛋白是來自于腦膜炎奈瑟氏球菌的一種外層膜蛋白。P64K蛋白作為載體蛋白可以幫助激活特異性體液免疫反應(yīng)，近年來研究顯示P64K較傳統(tǒng)載體蛋白BSA、TT等有更好的免疫增強(qiáng)效果。我們選擇P64K蛋白，通過一段多肽交聯(lián)橋(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)與G17的B細(xì)胞表位交聯(lián)或者是構(gòu)建G17P64K融合蛋白來作為治療性疫苗，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生抗胃泌素G17的抗體從而中和并清除內(nèi)分泌或者是源自腫瘤細(xì)胞自分泌的胃泌素，達(dá)到治療胃腸道腫瘤的目的。 我們從腦膜炎球菌中通過PCR克隆得到了P64K基因，構(gòu)建了P64K基因和G17P64K基因的pET28a表達(dá)載體，并在大腸桿菌中得到了高表達(dá)。目的蛋白經(jīng)硫酸銨沉淀、疏水層析、分子篩層析和陰離子層析得到純度超過90％的樣品。FMOC同相法化學(xué)合成多肽pyro-Glu-Gly-Pro-Trp-Leu-Glu-Glu-Glu-Glu-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Cys。MBS法交聯(lián)多肽與載體蛋白P64K及DT。制備抗胃泌素G17抗體試驗(yàn)分為5組：合成多肽組，P64K蛋白組，DT多肽交聯(lián)組、P64K多肽交聯(lián)組和G17P64K融合蛋白組，分別加氟氏佐劑后免疫兔。經(jīng)兩次加強(qiáng)免疫后在DT多肽交聯(lián)組和P64K多肽交聯(lián)組動(dòng)物血清中產(chǎn)生了高滴度的抗胃泌素G17抗體。細(xì)胞水平的體外活性評(píng)價(jià)試驗(yàn)顯示抗體有較好的抑制腫瘤生長(zhǎng)的生物學(xué)活性。
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2004
【分類號(hào)】：R392.1
【圖文】：

G細(xì)胞轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生唯一的長(zhǎng)度為0.7kb的胃泌素mRNA，在粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中翻譯生成101個(gè)氨基酸殘基的前胃泌素原(Preprogastrin)[3]。前胃泌素原經(jīng)不同方式的剪接產(chǎn)生多種結(jié)構(gòu)形式的胃泌素分子(見圖1)。前胃泌素原切除N端21個(gè)氨基酸長(zhǎng)的信號(hào)膚，生成胃泌素原(progastrin)而被轉(zhuǎn)運(yùn)到高爾基體。在高爾基體內(nèi)，胃泌素原第86位酪氨酸殘基(Tyr86)被硫酸化，第%位絲氨酸殘基(Ser96)被磷酸化修飾后，由高爾基體囊泡運(yùn)輸?shù)紾細(xì)胞基底的早期內(nèi)分泌顆粒內(nèi)。運(yùn)輸過程中，在胰蛋白酶、類梭基膚酶E的作用下，胃泌素原被降解生成甘氨酸延仲型胃泌素34。甘氨酸延伸型胃泌素34的N末端進(jìn)一步被蛋白酶剪切加工，再經(jīng)谷氨酞環(huán)化修飾后進(jìn)入內(nèi)分泌顆粒。在內(nèi)分泌顆粒內(nèi)

素G17治療性疫苗的研究第四章實(shí)驗(yàn)結(jié)果的克隆因的克隆方法3.1.1內(nèi)引物1、2為上下游引物，以腦膜炎CR擴(kuò)增尸64K基因，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析顯圖5所示條帶大小與預(yù)測(cè)結(jié)果一致。

方法311內(nèi)引物12為上下游引物，以腦膜炎CR擴(kuò)增尸64K基因，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析顯圖5所示條帶大小與預(yù)測(cè)結(jié)果一致。圖5P64K基因擴(kuò)增產(chǎn)物鑒定圖潛止密碼子的P64K’基因的克隆方法3.1.2內(nèi)引物1、3為上下游引物，PCR循環(huán)條電泳分析顯示條帶大小與預(yù)測(cè)結(jié)果一致(圖6)。

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本文編號(hào)：2781178