【摘要】： 將蛋白質(zhì)引入哺乳動物細胞的方法有很多，常用的有真核表達載體轉(zhuǎn)染、微注射、病毒感染等等。這些方法也許在某一特定的情況下非常適用，但其都不免操作復雜，難于調(diào)控。解決辦法之一就是應用蛋白轉(zhuǎn)導域(Proteintransduction domain,PTD)。將PTD與蛋白質(zhì)、多肽或DNA等分子共價連接或與目的基因融合表達后，PTD可將這些分子以一種不依賴受體和轉(zhuǎn)運蛋白的方式導入細胞。來源于HIV的TatPTD就是一種轉(zhuǎn)導能力很強的蛋白轉(zhuǎn)導域(本研究中簡稱TAT)。實驗證明TAT融合蛋白可導入小鼠體內(nèi)的所有組織和細胞，甚至可以通過血腦屏障。因此，TAT蛋白轉(zhuǎn)導系統(tǒng)被認為是一種很有前途的運載工具，無論對于基礎(chǔ)研究還是臨床治療，都有著非常廣泛的應用前景。 為了探索應用PTD將乙肝病毒靶向核糖核酸酶導入人體治療乙型肝炎的可行性，本研究中首先將乙肝病毒靶向核糖核酸酶(HBV targetedribonuclease,TR)基因及其對照—突變失活的乙肝病毒靶向核糖核酸酶(mutant targeted ribonuclease,TRmut)基因、乙肝病毒核心蛋白(HBV coreprotein,HBVc)基因、人嗜酸性粒細胞來源的神經(jīng)毒素(human eosinophil derived neurotoxin,hEDN)基因，分別克隆入含有蛋白轉(zhuǎn)導域TAT的pTAT-HA原核表達載體。在大腸桿菌BL21(DE3)LysS內(nèi)，以IPTG誘導融合蛋白表達，表達產(chǎn)物用SDS-PAGE及Western blot分析鑒定。優(yōu)化表達條件后大量 第四軍醫(yī)大學碩士學位論文 中文摘要 表達，在變性條件下以 Ni－NTA倉grose和 PD八 脫鹽柱進行純化。純化產(chǎn)物 的濃度及純度分析表明，成功地純化了四種TAT融合蛋白。以構(gòu)建的PET30a （＋）／TR、pET30a（＋）／TRmut及pET30a（＋）／HBVc轉(zhuǎn)化大腸桿菌BLZI （DE3）LySS，相同方法表達并純化不含TAT的對照蛋白。將四種TAT融合 蛋白及其對照分別加入培養(yǎng)的2．2．15細胞上清中，利用間接免疫熒光法檢測 TAT融合蛋白的跨膜轉(zhuǎn)導效率發(fā)現(xiàn)：經(jīng)TAT融合蛋白處理的細胞，胞漿中均 出現(xiàn)較強的綠色熒光；而經(jīng)不含TAT的對照蛋白處理的細胞則沒有熒光出現(xiàn)。 這一結(jié)果顯示制備的TAT融合蛋白可以高效的導入2．2二5細胞。我們采用固 相放免法檢測TATTR的抗病毒活性發(fā)現(xiàn)：與MOCK組相比加有TATTR的 實驗組細胞上清中 HBeAg的濃度下降了 60．3％；而TRmut、hEDN和 HBVc 組細胞上清中的HBeAg濃度與MOCK組的差異無統(tǒng)計學意義，說明制備的 TATTR具有較好的抗病毒活性。MTT檢測結(jié)果顯示TATTR并不影響細胞 的生長及代謝。由此我們得出結(jié)論：TAT乙肝病毒靶向核糖核酸酶融合蛋白 的制備及其抗病毒作用的初步研究，為應用靶向核糖核酸酶治療乙肝病毒感 染奠定了基礎(chǔ)。
【學位授予單位】：中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2003
【分類號】：R341
【圖文】：

四軍醫(yī)大學碩士學位論文研究內(nèi)容一聚合酶分子132，33]。在大腸桿菌、酵母和哺乳動物細胞中表達HBvC基因，可以得到27tun的核心顆粒，表明HBVc不需任何其他蛋白的參與即可自裝配成核心顆粒洲。HBv。梭基端的38個氨基酸組成4個富含精氨酸殘基Arg)的區(qū)域，用胰蛋白酶除去竣基端的這些區(qū)域后，HBVc喪失與RNA結(jié)合活性。在大腸桿菌中表達刪除梭基端編碼區(qū)的HBV�；�，表達產(chǎn)物能形成顆粒，但其中不再含有RNA，表明裝配核心顆粒所需的序列位于蛋的前153個氨基酸，而梭基末端富含精氨酸殘基的區(qū)域則含有RNA結(jié)合裝配的信號[35一38]。所以，選擇核心蛋白作為靶向分子可使融合蛋白更容易合到HBVpgRNA上，更好地發(fā)揮核糖核酸酶降解RNA的作用。(圖6)寡嘴息T獲人T匆O擬O少一

AGE分析Bvc轉(zhuǎn)化的BLZI;2:p丁AT-HA/hEDN轉(zhuǎn)化化的BL21;5:pl’A1飛HA/TR轉(zhuǎn)化的BLZI;6:plEanalysisofrAI，fusionProteinsrmedbyPTAI下HA舊BVe:2:Eeolitransfor4:E.colitransformedbyPl’AT-HA:5:E，eolitrarmedbyPTAT-HA/TRlnut向核糖核酸酶融合蛋白的Weste步明確1丫d飛革巴向核糖核酸酶在大腸血清進行了免疫印跡分析，結(jié)果如圖8顯的條帶，而兩個陰性對照均未出現(xiàn)‘rl卜TR的Westernblot分析導加鼠免疫血清;2:未誘導對照;3:血清對照;4:低分子蛋白標準

圖12重組質(zhì)粒的酶切鑒定1:PE下30a(+):2:PET-30a(+)/TR(勒刀oNA標志物(DL200o，2000，1000，750，5由上向下);4:pE不3oa(+)/HBve(KPnl/去Fig.12RestrictionenzymesdigesreC0mbinslltSI:PET-30a(+):2:PET-3Oa(+)/TR(KPnDNAMarkers(2000，1000，750，500，250，tobottom);4:pE不30a(+)/HBVc(舜腳I/純化的SDS~PAGE分析R、pET-30a(+)/TRlnut及PE下3Oa(+)/HBVeLysS后，表達并純化不含護D妞，的對照蛋)，SDS一PAGE分析的結(jié)果顯示對照蛋白純1031234567.5

【引證文獻】

相關(guān)博士學位論文 前1條

1 陳鴻軍;MDV CVI988弱毒疫苗株VP22蛋白轉(zhuǎn)導功能研究[D];揚州大學;2006年

本文編號：2758535