發(fā)布時(shí)間：2020-07-16 21:30

【摘要】： 將蛋白質(zhì)引入哺乳動物細(xì)胞的方法有很多，常用的有真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染、微注射、病毒感染等等。這些方法也許在某一特定的情況下非常適用，但其都不免操作復(fù)雜，難于調(diào)控。解決辦法之一就是應(yīng)用蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)域(Proteintransduction domain,PTD)。將PTD與蛋白質(zhì)、多肽或DNA等分子共價(jià)連接或與目的基因融合表達(dá)后，PTD可將這些分子以一種不依賴受體和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的方式導(dǎo)入細(xì)胞。來源于HIV的TatPTD就是一種轉(zhuǎn)導(dǎo)能力很強(qiáng)的蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)域(本研究中簡稱TAT)。實(shí)驗(yàn)證明TAT融合蛋白可導(dǎo)入小鼠體內(nèi)的所有組織和細(xì)胞，甚至可以通過血腦屏障。因此，TAT蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)被認(rèn)為是一種很有前途的運(yùn)載工具，無論對于基礎(chǔ)研究還是臨床治療，都有著非常廣泛的應(yīng)用前景。 為了探索應(yīng)用PTD將乙肝病毒靶向核糖核酸酶導(dǎo)入人體治療乙型肝炎的可行性，本研究中首先將乙肝病毒靶向核糖核酸酶(HBV targetedribonuclease,TR)基因及其對照—突變失活的乙肝病毒靶向核糖核酸酶(mutant targeted ribonuclease,TRmut)基因、乙肝病毒核心蛋白(HBV coreprotein,HBVc)基因、人嗜酸性粒細(xì)胞來源的神經(jīng)毒素(human eosinophil derived neurotoxin,hEDN)基因，分別克隆入含有蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)域TAT的pTAT-HA原核表達(dá)載體。在大腸桿菌BL21(DE3)LysS內(nèi)，以IPTG誘導(dǎo)融合蛋白表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物用SDS-PAGE及Western blot分析鑒定。優(yōu)化表達(dá)條件后大量 第四軍醫(yī)大學(xué)碩士學(xué)位論文 中文摘要 表達(dá)，在變性條件下以 Ni－NTA倉grose和 PD八 脫鹽柱進(jìn)行純化。純化產(chǎn)物 的濃度及純度分析表明，成功地純化了四種TAT融合蛋白。以構(gòu)建的PET30a （＋）／TR、pET30a（＋）／TRmut及pET30a（＋）／HBVc轉(zhuǎn)化大腸桿菌BLZI （DE3）LySS，相同方法表達(dá)并純化不含TAT的對照蛋白。將四種TAT融合 蛋白及其對照分別加入培養(yǎng)的2．2．15細(xì)胞上清中，利用間接免疫熒光法檢測 TAT融合蛋白的跨膜轉(zhuǎn)導(dǎo)效率發(fā)現(xiàn)：經(jīng)TAT融合蛋白處理的細(xì)胞，胞漿中均 出現(xiàn)較強(qiáng)的綠色熒光；而經(jīng)不含TAT的對照蛋白處理的細(xì)胞則沒有熒光出現(xiàn)。 這一結(jié)果顯示制備的TAT融合蛋白可以高效的導(dǎo)入2．2二5細(xì)胞。我們采用固 相放免法檢測TATTR的抗病毒活性發(fā)現(xiàn)：與MOCK組相比加有TATTR的 實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞上清中 HBeAg的濃度下降了 60．3％；而TRmut、hEDN和 HBVc 組細(xì)胞上清中的HBeAg濃度與MOCK組的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明制備的 TATTR具有較好的抗病毒活性。MTT檢測結(jié)果顯示TATTR并不影響細(xì)胞 的生長及代謝。由此我們得出結(jié)論：TAT乙肝病毒靶向核糖核酸酶融合蛋白 的制備及其抗病毒作用的初步研究，為應(yīng)用靶向核糖核酸酶治療乙肝病毒感 染奠定了基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2003
【分類號】：R341
【圖文】：

四軍醫(yī)大學(xué)碩士學(xué)位論文研究內(nèi)容一聚合酶分子132，33]。在大腸桿菌、酵母和哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)HBvC基因，可以得到27tun的核心顆粒，表明HBVc不需任何其他蛋白的參與即可自裝配成核心顆粒洲。HBv。梭基端的38個氨基酸組成4個富含精氨酸殘基Arg)的區(qū)域，用胰蛋白酶除去竣基端的這些區(qū)域后，HBVc喪失與RNA結(jié)合活性。在大腸桿菌中表達(dá)刪除梭基端編碼區(qū)的HBV�；�，表達(dá)產(chǎn)物能形成顆粒，但其中不再含有RNA，表明裝配核心顆粒所需的序列位于蛋的前153個氨基酸，而梭基末端富含精氨酸殘基的區(qū)域則含有RNA結(jié)合裝配的信號[35一38]。所以，選擇核心蛋白作為靶向分子可使融合蛋白更容易合到HBVpgRNA上，更好地發(fā)揮核糖核酸酶降解RNA的作用。(圖6)寡嘴息T獲人T匆O擬O少一

AGE分析Bvc轉(zhuǎn)化的BLZI;2:p丁AT-HA/hEDN轉(zhuǎn)化化的BL21;5:pl’A1飛HA/TR轉(zhuǎn)化的BLZI;6:plEanalysisofrAI，fusionProteinsrmedbyPTAI下HA舊BVe:2:Eeolitransfor4:E.colitransformedbyPl’AT-HA:5:E，eolitrarmedbyPTAT-HA/TRlnut向核糖核酸酶融合蛋白的Weste步明確1丫d飛革巴向核糖核酸酶在大腸血清進(jìn)行了免疫印跡分析，結(jié)果如圖8顯的條帶，而兩個陰性對照均未出現(xiàn)‘rl卜TR的Westernblot分析導(dǎo)加鼠免疫血清;2:未誘導(dǎo)對照;3:血清對照;4:低分子蛋白標(biāo)準(zhǔn)

圖12重組質(zhì)粒的酶切鑒定1:PE下30a(+):2:PET-30a(+)/TR(勒刀oNA標(biāo)志物(DL200o，2000，1000，750，5由上向下);4:pE不3oa(+)/HBve(KPnl/去Fig.12RestrictionenzymesdigesreC0mbinslltSI:PET-30a(+):2:PET-3Oa(+)/TR(KPnDNAMarkers(2000，1000，750，500，250，tobottom);4:pE不30a(+)/HBVc(舜腳I/純化的SDS~PAGE分析R、pET-30a(+)/TRlnut及PE下3Oa(+)/HBVeLysS后，表達(dá)并純化不含護(hù)D妞，的對照蛋)，SDS一PAGE分析的結(jié)果顯示對照蛋白純1031234567.5

【引證文獻(xiàn)】

相關(guān)博士學(xué)位論文 前1條

1 陳鴻軍;MDV CVI988弱毒疫苗株VP22蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)功能研究[D];揚(yáng)州大學(xué);2006年

本文編號：2758535