【摘要】：一、目的 BCG膀胱灌注是治療膀胱腫瘤防止其復(fù)發(fā)的最有效方法之一,但目前在治療中存在著給藥量大、療效不確切、易導(dǎo)致結(jié)核播散等并發(fā)癥,提示著必須對(duì)這一方法進(jìn)行改造。Ag85B是結(jié)核桿菌的主要分泌蛋白之一,是結(jié)核桿菌的主要保護(hù)性抗原。Ag85B基因的發(fā)現(xiàn)為膀胱腫瘤的治療提供了一條新的線索,利用分枝桿菌Ag85B的免疫原性,在膀胱癌及其它腫瘤治療中的應(yīng)用研究近年來(lái)受到重視。本科室正利用Ag85B基因?qū)Π螂啄[瘤的治療進(jìn)行進(jìn)一步的研究,希望找到一種治療膀胱腫瘤的新的有效方法。本實(shí)驗(yàn)的目的是制備兔抗Ag85B多克隆抗體, 為相關(guān)的研究提供實(shí)驗(yàn)室素材,用來(lái)鑒定融合蛋白內(nèi)或組織里的Ag85B蛋白。 二、研究?jī)?nèi)容及結(jié)果 本研究中首先構(gòu)建編碼結(jié)核分枝桿菌Ag85B分泌蛋白的重組表達(dá)質(zhì)粒,將此質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌,誘導(dǎo)表達(dá)融合蛋白并加以純化;然后將純化的蛋白免疫家兔,提取家兔的抗體血清,純化制備多克隆抗體并進(jìn)行鑒定。主要研究?jī)?nèi)容和結(jié)果如下: 1.用EcoRI和SalI雙酶切,從pUC18-Ag85B質(zhì)粒上切下Ag85B基因片段,然后將該片段插入經(jīng)過(guò)同樣雙酶切的融合表達(dá)載體pGEX-4T-1中,構(gòu)建重組pGEX-Ag85B質(zhì)粒。酶切鑒定及測(cè)序結(jié)果表明,成功構(gòu)建了原核表達(dá)質(zhì)粒pGEX-Ag85B; 2.將pGEX-Ag85B重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21,重組基因工程大腸桿菌發(fā)酵后,用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)GST-Ag85B融合蛋白,其主要是以包涵體的形式存在,洗滌包涵體進(jìn)行初步純化,將包涵體進(jìn)行變性和緩慢稀釋復(fù)性,用Sepharose High Performance離子柱分離純化,SDS-PAGE電泳分析該蛋白純度達(dá)到了95%以上; 3.將純化的GST-Ag85B融合蛋白作為抗原,在與佐劑乳化后,免疫家兔共4次,抽取家兔的抗血清,用鹽析法粗提IgG多克隆抗體,離子交換法進(jìn)一步純化抗體。酶聯(lián)免疫測(cè)定法(ELISA)鑒定抗體,證明制備的多克隆抗體可以與 GST-Ag85B融合蛋白相結(jié)合,產(chǎn)生抗原-抗體反應(yīng)。 4.利用Ag85B多克隆抗體對(duì)本科室制備的Ag85B/IL-2融合蛋白進(jìn)行鑒定。 WP=9 Western-blot結(jié)果證實(shí)所制備的多克隆抗體可有效識(shí)別原核細(xì)胞表達(dá)的Ag85B/IL-2融合蛋白。 三、結(jié)論 成功制備了Ag85B多克隆抗體,初步應(yīng)用效果滿意,為Ag85B與膀胱腫瘤的研究提供了重要的實(shí)驗(yàn)室素材,為進(jìn)一步的研究奠定了基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2004
【分類號(hào)】：R346
【圖文】：

1：誘前樣 4：破菌液離心上清2：誘后樣 5：破菌液離心上清3：破菌液離心沉淀 6：蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)圖 8 表達(dá)形式的考查、分離純化1 2 3 4 5 6

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前8條

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本文編號(hào)：2755994