發(fā)布時(shí)間：2020-07-14 19:56

【摘要】：激肽釋放酶是絲氨酸蛋白酶家族的一員，可水解由精氨酸、賴氨酸等堿性氨基酸形成的肽鍵。生物體內(nèi)激肽釋放酶分為兩類：血漿激肽釋放酶和組織激肽釋放酶。激肽釋放酶在體內(nèi)可特異性水解血漿或組織中的激肽原(或前激肽)產(chǎn)生緩激肽，后者則與細(xì)胞上的緩激肽B1、B2受體結(jié)合，釋放第二信使cGMP、NO等來激活其他一系列的生理生化反應(yīng)，如肌肉收縮、血管滲漏、嗜中性粒細(xì)胞趨化、疼痛炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)、血細(xì)胞生長(zhǎng)等。臨床的一些研究發(fā)現(xiàn)高血壓和糖尿病的發(fā)病常伴隨著體內(nèi)激肽釋放酶水平的降低，而激肽釋放酶水平偏高可能與哮喘、關(guān)節(jié)炎等的發(fā)病有關(guān)。 激肽釋放酶所具有的多種生理功能，使它成為了一種重要的臨床用藥。目前主要用于微循壞障礙性疾病，如糖尿病引起的腎病，周圍神經(jīng)病，視網(wǎng)膜病，眼底病及缺血性腦血管病，以及高血壓病的輔助治療。近年來隨著糖尿病患者的增多，對(duì)激肽釋放酶的需求量也同益增加。市場(chǎng)上現(xiàn)有的激肽釋放酶產(chǎn)品主要為豬胰激肽釋放酶，也有少量為人尿激肽釋放酶。盡管已有實(shí)驗(yàn)室報(bào)道成功構(gòu)建了人組織激肽釋放酶的真核表達(dá)系統(tǒng)和原核表達(dá)系統(tǒng)，但由于存在著表達(dá)量低、產(chǎn)物活性低等缺點(diǎn)，自今尚未見用作工業(yè)生產(chǎn)的報(bào)道。而豬胰臟因其具有來源豐富，價(jià)格低廉等優(yōu)點(diǎn)，目前仍是臨床用藥的主要來源。而當(dāng)前所用的純化工藝多為離子交換法或固定化底物(approtinin)親和層析法，存在著回收率低、使用壽命短等缺點(diǎn)。因此，進(jìn)行激肽釋放酶純化新二工藝研究具有重要理論意義和經(jīng)濟(jì)意義。 本實(shí)驗(yàn)是以脫脂的豬胰酶粗粉為原料，根據(jù)激肽釋放酶的空間結(jié)構(gòu)和其對(duì)底物的結(jié)合特點(diǎn)，以激肽釋放酶的最佳底物——Phe—Arg二肽為模型，設(shè)計(jì)并合成了六種以三氮嗪為母核的小分子染料配基來對(duì)激肽釋放酶進(jìn)行仿生親和純化，并從中篩選出了一種結(jié)合力較強(qiáng)，特異性較高的配基——Trp介質(zhì)。在將上樣、沈脫條件優(yōu)化(pH8，電導(dǎo)為3.5ms上樣；pH8.5，電導(dǎo)10ms沈脫)后，單獨(dú)使用該介質(zhì)可一步從豬胰丙酮粗粉中純化出比活性為350KU／mg的激 膚釋放酶樣品，比原樣比活提高了290倍，回收率為68%。而將該柱和 DEAE一FF一SePharose聯(lián)用，所得洗脫液中激膚釋放酶比活可達(dá)1 300KU/mg， 比原樣(丙酮粗粉)比活提高了1300多倍，回收率達(dá)63%。同時(shí)進(jìn)行的介質(zhì) 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)、吸附容量測(cè)定、放大實(shí)驗(yàn)也取得了較為理想的結(jié)果。本工藝和現(xiàn) 有其它工藝相比，具有步驟簡(jiǎn)單、回收率高、介質(zhì)壽命長(zhǎng)等優(yōu)點(diǎn)，因此本介質(zhì) 及其工藝具有較強(qiáng)的市場(chǎng)應(yīng)用前景。
【學(xué)位授予單位】：華中師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2004
【分類號(hào)】：Q55
【圖文】：

.0計(jì)算第3泳道條帶分子量30K0，純度98%。協(xié)L進(jìn)行反相色譜分析，詳見步驟22.4.2反相色譜分析，結(jié)果見圖3一11。其中樣品保留時(shí)間和標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照保留時(shí)間基本一致，HS2000分析純度為90%，說二二)))))一一七七七七七七七006一{。。4…{0乃2刊{0習(xí)O-nu}亡、0加5加IODO15刃020D0圖3一11樣品HPLC圖譜OEA.FF一Separose洗脫峰2的HPLC圖譜(右圖)，左圖為激膚釋放酶標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC圖譜�？墒�·出二者土峰保留時(shí)間均在16.smin左右，和標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間基本一致。用HS2000軟件進(jìn)行純度分析分析顯示，DEAE洗脫峰2的HPLC純度為90%。明所得的樣品中除少量雜蛋白外，大部分蛋白成分為激膚釋放酶。

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