【摘要】：目的:從家蠅的EST測序數(shù)據(jù)庫中篩選獲得家蠅的CCT(chaperonin containing t-complex polypeptide)基因MD-CCTζ,上傳Gen Bank分析分子特性后,進行c DNA克隆、表達;探討MD-CCTζ基因在家蠅不同組織和發(fā)育時期的時空表達模式;初步研究在不同病原微生物和熱脅迫條件下家蠅3齡幼蟲的MD-CCTζ基因表達譜的變化。方法:1、MD-CCTζ的序列分析及c DNA克隆、表達。從課題組前期構建的家蠅幼蟲EST數(shù)據(jù)庫中篩選得到家蠅的CCTζ基因序列,通過序列分析,預測其開放閱讀框,采用BLAST、EXPASY等生物信息學網(wǎng)站分析預測MD-CCTζ基因編碼蛋白的結構域,二級及三級結構等;從NCBI上下載其他物種CCTζ基因的氨基酸序列,借助MEGA 6.0軟件采用鄰接法構建系統(tǒng)進化樹;根據(jù)其c DNA序列設計引物,PCR擴增MD-CCTζ基因,將目的基因與表達載體PEASY-E1構建重組質粒,轉化到大腸桿菌BL21(DE3)中,選擇合適溫度、時間使用IPTG誘導重組蛋白,重組蛋白使用His·Tag融合蛋白試劑盒純化。2、家蠅CCTζ基因的時空表達分析。分別收集家蠅生活史各發(fā)育階段不同蟲態(tài)(卵、1齡幼蟲、2齡幼蟲、3齡幼蟲、蛹),成蟲不同性別(雌蟲和雄蟲)的蟲體,提取總RNA后并逆轉錄為c DNA,以GAPDH基因為內參基因,采用實時熒光定量PCR(Real Time PCR)技術檢測MD-CCTζ基因不同發(fā)育時期的表達差異;解剖家蠅3齡幼蟲,選擇幼蟲的六種具有典型特征的組織器官(脂肪體、唾液腺、中腸、氣管、馬氏管和體壁)。提取相應組織的總RNA并轉錄為c DNA。采用Real Time PCR檢測MD-CCTζ基因的空間表達差異。3、MD-CCTζ基因在家蠅3齡幼蟲脅迫條件下的功能初探。分別將定量的不同病原微生物(白色念珠菌、大腸桿菌和及金黃色葡萄球菌)采用注射法導入到家蠅3齡幼蟲體內,采用Real Time PCR檢測誘導后不同時間點(3h、6h、12h、18h、24h、36h、48h)CCTζ基因表達水平的變化。將3齡幼蟲42℃熱脅迫,采用Real Time PCR檢測脅迫(0h、15min、30min、1h、1.5h、2h)后不同時間點MD-CCTζ基因表達水平的變化。結果:1、生物信息學分析結果顯示,MD-CCTζ的ORF框全長1596 bp,編碼一個含531個氨基酸的蛋白多肽,理論分子量為58260.47Da,等電點為6.56;無信號肽和跨膜結構域,有2個CCT蛋白標簽,具有CCT的功能結構域,MD-CCTζ的三級結構有多個α螺旋和β折疊,通過不規(guī)則卷曲相連,進化樹比對分析與地中海實蠅CCT的遺傳距離較近。成功構建了MD-CCTζ表達載體,經(jīng)IPTG誘導,重組蛋白獲得表達,并得到純化蛋白。2、MD-CCTζ基因在家蠅體內的時空表達模式結果顯示,在家蠅卵、各齡幼蟲、蛹和雌雄成蟲各階段中,MD-CCTζ基因有不同程度的表達。MD-CCTζ基因在卵期表達量最高,其表達水平排列為卵雌蟲2齡幼蟲1齡幼蟲蛹雄蟲3齡幼蟲。3、家蠅3齡幼蟲的各主要組織中,MD-CCTζ基因在唾液腺和氣管中的表達水平明顯比體壁、脂肪體、中腸和馬氏管高,MD-CCTζ基因在各組織表達量為:唾液腺氣管馬氏管中腸脂肪體體壁。4、大腸桿菌誘導后MD-CCTζ在3h開始輕微上調,到6h、18h、36h出現(xiàn)下調,在12h、24h、48h為上調狀態(tài),24h表達量最高。金黃色葡萄球菌、白色念珠菌誘導后在24h表達量最高,其它時間點MD-CCTζ基因表達趨于基礎免疫狀態(tài)。5、家蠅3齡幼蟲在熱脅迫條件下的MD-CCTζ基因在15min后上調,在2h顯著上調表達。結論:1、本研究成功對MD-CCTζ基因分子特性進行了分析、克隆并表達了MD-CCTζ基因,得到了體外重組蛋白。2、初步揭示了MD-CCTζ基因在家蠅體內的時空表達模式,提示MD-CCTζ基因在家蠅生長發(fā)育過程中具有重要作用。3、MD-CCTζ基因在家蠅幼蟲受到病原微生物及熱脅迫后表達量明顯上調,提示MD-CCTζ基因參與了家蠅的抗脅迫過程,與家蠅幼蟲抵抗外界不利環(huán)境有直接關系。
【學位授予單位】：貴陽醫(yī)學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R384.2
【圖文】：

圖2-1 BLAST中MD-CCTζ保守結構域分析Fig2-1 conserved domains analysis of MD-CCTζ in BLAST2.1.2 基本性質分析及其跨膜區(qū)、信號肽分析用 DNAman 分析軟件對 MD-CCTζ 基因序列進行分析，MD-CCTζ 基因序列包含一個 1596 bp 的完整開放閱讀框（ORF），包括起始密碼子 ATG 和終止密碼子TAG,編碼一個由 531 個氨基酸組成的蛋白。利用瑞士生物信息學研究所的蛋白分析專家系統(tǒng)分析編碼蛋白的理論等電點: 6.56 ，分子量： 58260.47Da(圖 2-2）。1 ATGGCTTCAATTAGTTTATTGAATCCTAAAGCTGAATACGCTCGCGCTGCAAATGCCTTG1 M A S I S L L N P K A E Y A R A A N A L61 GCCTTTAACATCTCGGCTGCCAAAGGTTTGCAAGATGTCATGCGGACCAATTTGGGACCT21 A F N I S A A K G L Q D V M R T N L G P121 AAAGGAACAATGAAAATGTTGGTGTCGGGAGCTGGCGACATTAAAATCACCAAGGATGGT41 K G T M K M L V S G A G D I K I T K D G181 AATATTCTTTTGCATGAAATGCAAATTCAACATCCCACCGCATCGATGATTGGCCATGCT

MD-CCTζ蛋白的SignalP-4.1分析結果

MD-CCTζ蛋白的TMHMM分析結果

【參考文獻】

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2 韓丁培;王蒲雄志;瞿順;陳雪華;宗雅萍;馮波;陸愛國;鄭民華;;伴侶蛋白CCT6A參與結腸癌細胞遷移及侵襲的作用研究[J];外科理論與實踐;2011年04期

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本文編號：2753912