本文關(guān)鍵詞：弓形蟲ROP16的表達(dá)及其調(diào)控宿主細(xì)胞凋亡的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的:將弓形蟲棒狀體16蛋白在體外表達(dá)并將其純化后,制備兔抗多克隆抗體。構(gòu)建ROP16真核表達(dá)載體并轉(zhuǎn)染入293T細(xì)胞,使其成功表達(dá)ROP16蛋白,探討ROP16對293T細(xì)胞凋亡的影響。方法:分別構(gòu)建重組質(zhì)粒ROP16/p TG19-T和ROP16/p ET32a,并于Rosetta中誘導(dǎo)表達(dá)。通過KCl染色切膠法對重組蛋白進行純化,制備多克隆抗體,并用Western blotting和IFA技術(shù)分別對其進行鑒定。構(gòu)建ROP16真核表達(dá)重組質(zhì)粒p3XFLAG-Myc-CMV?-24-ROP16,并用PCR和雙酶切法進行鑒定,提取無內(nèi)毒素陽性質(zhì)粒。采用瞬時轉(zhuǎn)染法使得重組蛋白在293T細(xì)胞中表達(dá),在三個不同時間點收集標(biāo)本,用Wenstern blotting和RT-PCR法檢測分別定量和定性檢測ROP16在293T細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)。將293T細(xì)胞接種于培養(yǎng)板中,待細(xì)胞長至60%左右(≤24h),向細(xì)胞中轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒和p3XFLAG-Myc-CMV?-24-ROP16重組質(zhì)粒。使用0.5μg/ml Act D誘導(dǎo)凋亡。于轉(zhuǎn)染后24 h、48 h收集標(biāo)本,分別用于以下實驗:將標(biāo)本用Annexin V-FITC/PI染色以及TUNEL Bright Green試劑盒染色,檢測凋亡率。提取標(biāo)本中RNA并反轉(zhuǎn)錄為c DNA,RT-PCR法檢測Bcl-2/Bax及Caspase3的變化。結(jié)果:成功擴增出ROP16基因片段并構(gòu)建ROP16原核表達(dá)重組質(zhì)粒。電泳結(jié)果顯示99.8 k Da處有符合大小的條帶。將純化后重組蛋白免疫家兔并獲得多克隆抗體。Western blotting結(jié)果顯示在74 k Da處有符合大小條帶,IFA結(jié)果顯示目的蛋白的綠色熒光分布在弓形蟲速殖子的胞質(zhì)內(nèi),具體位置為細(xì)胞核前端。成功構(gòu)建真核表達(dá)重組載體p3XFLAG-Myc-CMV?-24-ROP16,轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后三個時間點的樣本經(jīng)Western blotting均能檢測出符合大小的條帶,根據(jù)條帶的粗細(xì)判斷蛋白表達(dá)量與時間成正比。數(shù)據(jù)統(tǒng)計結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染ROP16的實驗組凋亡率均低于對照組,并且在24h、48h兩組差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。轉(zhuǎn)染后24 h、48 h,ROP16轉(zhuǎn)染組Bcl-2/Bax明顯高于空載轉(zhuǎn)染組(P0.05)。ROP16轉(zhuǎn)染組Caspase3與actin比值明顯低于空載轉(zhuǎn)染組(P0.05)。結(jié)論:成功構(gòu)建了原核表達(dá)重組質(zhì)粒ROP16/p ET32a,并制備ROP16兔抗多克隆抗體,對多克隆抗體分別進行定性和定量分析,證明其具有較高的免疫反應(yīng)活性。ROP16蛋白在宿主細(xì)胞中成功表達(dá),并且對宿主細(xì)胞凋亡有抑制作用。
【關(guān)鍵詞】：弓形蟲 ROP16 原核表達(dá) 293T細(xì)胞 凋亡
【學(xué)位授予單位】：江蘇大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R382.5
【目錄】：

• 摘要5-7
• ABSTRACT7-13
• 主要縮略詞表13-14
• 第一章 緒論14-18
• 1.1 弓形蟲入侵機制14
• 1.2 弓形蟲入侵相關(guān)蛋白14-15
• 1.3 弓形蟲感染與細(xì)胞凋亡15
• 1.4 ROP16研究現(xiàn)狀15-16
• 1.5 本課題意義16-18
• 第二章 弓形蟲ROP16的原核表達(dá)18-42
• 2.1 實驗儀器和材料18-23
• 2.1.1 實驗儀器18
• 2.1.2 實驗耗材18
• 2.1.3 實驗試劑18-19
• 2.1.4 試劑配制19-23
• 2.1.5 載體與菌株23
• 2.1.6 細(xì)胞和蟲體23
• 2.2 實驗方法23-34
• 2.2.1 HFF細(xì)胞系的傳代培養(yǎng)23
• 2.2.2 弓形蟲速殖子的培養(yǎng)23-24
• 2.2.3 弓形蟲速殖子DNA提取24
• 2.2.4 弓形蟲ROP16基因的擴增24-26
• 2.2.5 弓形蟲ROP16/pTG19-T載體的構(gòu)建與鑒定26-28
• 2.2.6 ROP16/pET32a原核表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定28-30
• 2.2.7 ROP16蛋白的表達(dá)與純化30-34
• 2.3 結(jié)果34-40
• 2.3.1 弓形蟲ROP16基因的擴增34
• 2.3.2 ROP16/pTG19-T重組質(zhì)粒鑒定34-36
• 2.3.3 ROP16/pET32a重組質(zhì)粒鑒定36-37
• 2.3.4 ROP16重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá)及可溶性分析37-39
• 2.3.5 Ni-NTA親和層析純化法純化目的蛋白39
• 2.3.6 KCl染色切膠法純化ROP16重組蛋白39-40
• 2.4 討論40-42
• 第三章 ROP16多抗的制備與鑒定42-52
• 3.1 實驗儀器和材料42-45
• 3.1.1 實驗儀器42
• 3.1.2 實驗動物42
• 3.1.3 實驗耗材42
• 3.1.4 試劑及其配制42-45
• 3.1.5 細(xì)胞和蟲體45
• 3.2 實驗方法45-48
• 3.2.1 ROP16多克隆抗體的制備45-47
• 3.2.2 ROP16多克隆抗體的鑒定47-48
• 3.3 結(jié)果48-50
• 3.3.1 ELISA檢測多克隆抗體效價48-49
• 3.3.2 Western blotting檢測多克隆抗體49
• 3.3.3 IFA檢測弓形蟲ROP16的表達(dá)49-50
• 3.4 討論50-52
• 第四章 弓形蟲ROP16的真核表達(dá)52-64
• 4.1 實驗儀器和材料52-53
• 4.1.1 實驗儀器52
• 4.1.2 實驗耗材52
• 4.1.3 實驗試劑及其配制52
• 4.1.4 載體與菌株52
• 4.1.5 細(xì)胞和蟲體52-53
• 4.2 實驗方法53-59
• 4.2.1 ROP16真核表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定53-55
• 4.2.2 p3XFLAG-Myc-CMV?24ROP16質(zhì)粒和空質(zhì)粒的大量提取55
• 4.2.3 293T細(xì)胞的復(fù)蘇與培養(yǎng)55-56
• 4.2.4 p3XFLAG-Myc-CMV?24ROP16轉(zhuǎn)染 293T細(xì)胞56
• 4.2.5 Western blotting法檢測ROP16的表達(dá)56-57
• 4.2.6 RT-PCR法檢測ROP16在 293T細(xì)胞中的表達(dá)57-59
• 4.3 結(jié)果59-61
• 4.3.1 ROP16真核表達(dá)載體的PCR和雙酶切鑒定59-60
• 4.3.2 ROP16在 293T細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的檢測60-61
• 4.4 討論61-64
• 第五章 ROP16對 293T細(xì)胞凋亡的影響64-76
• 5.1 實驗儀器與材料64-65
• 5.1.1 實驗儀器64
• 5.1.2 實驗耗材64
• 5.1.3 實驗試劑及配制64-65
• 5.1.4 細(xì)胞65
• 5.2 實驗方法65-70
• 5.2.1 293T細(xì)胞的復(fù)蘇與培養(yǎng)65
• 5.2.2 293T細(xì)胞的轉(zhuǎn)染與凋亡的誘導(dǎo)65
• 5.2.3 Annexin V-FITC/PI法檢測 293T細(xì)胞凋亡65-66
• 5.2.4 TUNEL法檢測 293T細(xì)胞凋亡66-67
• 5.2.5 RT-PCR法檢測凋亡相關(guān)基因67-70
• 5.3 結(jié)果70-74
• 5.3.1 AnnexinV-FITC/PI法檢測細(xì)胞凋亡70-71
• 5.3.2 TUNEL法檢測細(xì)胞凋亡71-72
• 5.3.3 凋亡相關(guān)因子Bcl-2、Bax的檢測72-73
• 5.3.4 凋亡相關(guān)因子Caspase3的檢測73-74
• 5.4 討論74-76
• 結(jié)論與展望76-78
• 參考文獻78-86
• 致謝86-88
• 讀研期間發(fā)表論文、參加課題88-89

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