【摘要】：對(duì)于各種終末期肝病，臨床上主要采取基礎(chǔ)療法和對(duì)癥治療，肝移植作為治療急、慢性肝衰竭的有效手段，由于供肝缺乏、費(fèi)用昂貴、免疫排斥等問(wèn)題，使其臨床應(yīng)用受限。雖然生物人工肝對(duì)改善終末期肝病患者癥狀、延緩預(yù)后有一定作用，但由于肝細(xì)胞來(lái)源匱乏，限制了其臨床應(yīng)用，肝細(xì)胞移植治療也因肝細(xì)胞來(lái)源所限而停滯不前。目前迫切需要找到一種高效治療肝病的措施，或解決肝細(xì)胞的來(lái)源問(wèn)題。干細(xì)胞研究的進(jìn)展為利用干細(xì)胞移植和／或干細(xì)胞工程生產(chǎn)肝細(xì)胞來(lái)治療各種肝病提供了可能性。 目前干細(xì)胞研究領(lǐng)域中最受重視的是對(duì)骨髓干細(xì)胞的研究。骨髓中有兩類干細(xì)胞，一類是造血干細(xì)胞(hematopoietic stem cells，HSCs)，另一類是間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)。骨髓MSCs來(lái)源于中胚層，具有很強(qiáng)的自我復(fù)制能力，能產(chǎn)生具有各種表型的子代細(xì)胞，在特定的誘導(dǎo)條件下可分化為成骨細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、成肌細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞等。骨髓MSCs一方面因其取材方便對(duì)身體健康損害小，另一方面用自體干細(xì)胞誘導(dǎo)構(gòu)建的組織不存在MHC限制，所以日益受到重視。最近通過(guò)細(xì)胞移植顯示，在體內(nèi)骨髓MSCs也有形成肝細(xì)胞的能力。因此，本課題旨在體外培養(yǎng)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞及其亞型HLA-DR~-C-Kit~-細(xì)胞，觀察HGF、FGF4以及兩者聯(lián)用對(duì)培養(yǎng)的人骨髓MSCs及HLA-DR~-C-Kit~-細(xì)胞的作用，尋找影響和調(diào)節(jié)這兩類細(xì)胞向肝細(xì)胞樣細(xì)胞定向分化的最佳條件，探討體外誘導(dǎo)培養(yǎng)獲取具有表型和功能特征的肝細(xì)胞樣細(xì)胞的可能性，如果誘導(dǎo)成功，可為現(xiàn)代細(xì)胞工程學(xué)提供新的細(xì)胞來(lái)源，為臨床上終末期肝病的治療帶來(lái)新的希望。 鄭州大學(xué)2004年碩士研究生畢業(yè)論丈 體外誘導(dǎo)人甘髓間充質(zhì)干細(xì)胞及其亞群lILA~DRC一kif細(xì)胞向肝系細(xì)胞分化的實(shí)驗(yàn)研究 材料和方法 骨髓細(xì)胞來(lái)源于健康志愿者的胸骨，年齡2一35歲。本實(shí)驗(yàn)分兩組:A組:骨髓 間充質(zhì)干細(xì)胞組;B組:HLA一DR一C一Kit一細(xì)胞組。A組細(xì)胞通過(guò)密度梯度離心(密度 1.0779/ml)獲得。在細(xì)胞達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后傳至第三代時(shí)，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)骨髓間充 質(zhì)干細(xì)胞的純度。B組細(xì)胞為第三代的A組細(xì)胞用磁式分離儀分離獲得。以上兩組細(xì)胞 在達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期之前用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基(低糖)培養(yǎng)，在細(xì)胞達(dá)到 對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后開始誘導(dǎo)時(shí)，接種于預(yù)先鋪有爬片的24孔培養(yǎng)板中，爬片預(yù)先用1林g/m1F’N (纖維連接素)處理，用含5%FBS、1 X ITS(胰島素一轉(zhuǎn)鐵素一硒混合物)、lmg/m1BSA (牛血清白蛋白)、4.7林g/ml亞油酸、10一SM幾地塞米松、10一樹L抗壞血酸、loou/ml 青霉素、100U/m1鏈霉素以及10ng/m1EGF的DF培養(yǎng)基培養(yǎng)，根據(jù)所加生長(zhǎng)因子的不 同又各分為四組:HGF(HePatoeyte即o，幾h factor，肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子)組、FoF4(Fibroblast grov改h factor一4，纖維母細(xì)胞生長(zhǎng)因子一4)組、HGF+FGF4組以及無(wú)生長(zhǎng)因子組，每組設(shè) 12個(gè)復(fù)孔。 以上各組細(xì)胞接種密度為2 xl護(hù)/c mZ，分別留取新鮮分離的細(xì)胞及各組誘導(dǎo)培養(yǎng) 后O天、7天、14天、21天、28天時(shí)的細(xì)胞，用免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測(cè)肝系細(xì)胞的特 異性標(biāo)志:CK18、AFP、白蛋白以檢測(cè)誘導(dǎo)后的細(xì)胞表型，用PAS法進(jìn)行糖原染色檢 測(cè)誘導(dǎo)后的細(xì)胞功能，Rl，一PCR法檢測(cè)新鮮分離的骨髓細(xì)胞中AFP、C一met(HGF受體)、 FGFRZ(FGF4受體)的mRNA表達(dá)情況。 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:各指標(biāo)的陽(yáng)性表達(dá)情況在不同時(shí)間點(diǎn)、不同組、不同處理因素之間的 比較，陽(yáng)性率以無(wú)勺表示，以。=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)，用sPsslo.o軟件分析，采用重復(fù)測(cè) 量數(shù)據(jù)方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。 結(jié)果 1密度梯度離心法分離的人骨髓細(xì)胞，大小均勻，透亮度好，臺(tái)盼藍(lán)染色細(xì)胞活 率95%。細(xì)胞達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后傳至第三代后，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面抗原CD29 和CD44，表達(dá)率分別為90.6%和91 .5%，說(shuō)明分離的人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞純度較高。 2磁式分離儀所得的HLA一DR一C一擻t一細(xì)胞，在倒置顯微鏡下觀察，細(xì)胞透亮度 好，臺(tái)盼藍(lán)染色細(xì)胞活率95%。 3人骨髓MSCs24小時(shí)內(nèi)貼壁，以后逐漸增多，細(xì)胞成克隆性生長(zhǎng)，3天時(shí)可見 鄭州大學(xué)2004年碩士研究生畢業(yè)論文 體外誘導(dǎo)人骨做間充質(zhì)干細(xì)胞及其亞群HLA一D玄C一kif細(xì)胞向肝系細(xì)胞分化的實(shí)驗(yàn)研究 到呈梭形的細(xì)胞，10天左右可達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。進(jìn)行磁式分離后，細(xì)胞24小時(shí)內(nèi)迅速 貼壁、伸展，增殖迅速，3一4天即可達(dá)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。 4在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)單用HGF誘導(dǎo)時(shí)細(xì)胞增殖速度慢，而單用FGF4及聯(lián) 用HGF和FGF4誘導(dǎo)時(shí)細(xì)胞增殖速度較快。 5新分離的細(xì)胞及兩組細(xì)胞在誘導(dǎo)0天時(shí)均未檢測(cè)到肝系細(xì)胞的標(biāo)志，然而用 RT一PCR法可在新分離的骨髓細(xì)胞中檢測(cè)到AFP以及c一met和FGFRZ mRNA表達(dá)。 6兩組細(xì)胞用含生長(zhǎng)因子的培養(yǎng)基培養(yǎng)后均可檢測(cè)到肝系細(xì)胞的標(biāo)志，而不含生 長(zhǎng)因子的培養(yǎng)基培養(yǎng)后未檢測(cè)到相應(yīng)標(biāo)志的表達(dá)。 7統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示，CK18、AFP、白蛋白以及糖原這四個(gè)指標(biāo)的陽(yáng)性率在兩組之 間均無(wú)明顯差異沙0.05)，在單用HGF、單用FGF4或兩者聯(lián)用時(shí)也無(wú)明顯差異印0.05)， 各指標(biāo)的陽(yáng)性率隨培養(yǎng)時(shí)間的變化而有差異印0.01)。 結(jié)論 1密度梯度離心法適于分離人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，且活率和
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2004
【分類號(hào)】：R329.2

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前4條

1 滕光菊;現(xiàn)代生物人工肝支持系統(tǒng)的細(xì)胞選擇及研究進(jìn)展[J];國(guó)外醫(yī)學(xué)(流行病學(xué)傳染病學(xué)分冊(cè));2002年01期

2 劉曉丹,郭子寬,李秀森,張雙喜,毛寧;人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分離與培養(yǎng)方法的建立[J];軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院院刊;2000年04期

3 李文晰,段芳齡,馬軍,朱武凌,高天慧,陳香宇,顏伏歸,李蔚,韓娜,王曉,孫艷,孫嫣;人骨髓單個(gè)核細(xì)胞向肝細(xì)胞誘導(dǎo)分化的體外研究[J];胃腸病學(xué)和肝病學(xué)雜志;2003年02期

4 徐令,黃紹良,李樹濃,周燦權(quán),喬春平,張敏芳;人的類胚胎干細(xì)胞的分離和培養(yǎng)[J];中山醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào);1998年01期

本文編號(hào)：2750731