發(fā)布時間：2020-07-11 17:53

【摘要】：對于各種終末期肝病，臨床上主要采取基礎療法和對癥治療，肝移植作為治療急、慢性肝衰竭的有效手段，由于供肝缺乏、費用昂貴、免疫排斥等問題，使其臨床應用受限。雖然生物人工肝對改善終末期肝病患者癥狀、延緩預后有一定作用，但由于肝細胞來源匱乏，限制了其臨床應用，肝細胞移植治療也因肝細胞來源所限而停滯不前。目前迫切需要找到一種高效治療肝病的措施，或解決肝細胞的來源問題。干細胞研究的進展為利用干細胞移植和／或干細胞工程生產(chǎn)肝細胞來治療各種肝病提供了可能性。 目前干細胞研究領域中最受重視的是對骨髓干細胞的研究。骨髓中有兩類干細胞，一類是造血干細胞(hematopoietic stem cells，HSCs)，另一類是間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)。骨髓MSCs來源于中胚層，具有很強的自我復制能力，能產(chǎn)生具有各種表型的子代細胞，在特定的誘導條件下可分化為成骨細胞、成軟骨細胞、脂肪細胞、成肌細胞和神經(jīng)細胞等。骨髓MSCs一方面因其取材方便對身體健康損害小，另一方面用自體干細胞誘導構建的組織不存在MHC限制，所以日益受到重視。最近通過細胞移植顯示，在體內(nèi)骨髓MSCs也有形成肝細胞的能力。因此，本課題旨在體外培養(yǎng)人骨髓間充質(zhì)干細胞及其亞型HLA-DR~-C-Kit~-細胞，觀察HGF、FGF4以及兩者聯(lián)用對培養(yǎng)的人骨髓MSCs及HLA-DR~-C-Kit~-細胞的作用，尋找影響和調(diào)節(jié)這兩類細胞向肝細胞樣細胞定向分化的最佳條件，探討體外誘導培養(yǎng)獲取具有表型和功能特征的肝細胞樣細胞的可能性，如果誘導成功，可為現(xiàn)代細胞工程學提供新的細胞來源，為臨床上終末期肝病的治療帶來新的希望。 鄭州大學2004年碩士研究生畢業(yè)論丈 體外誘導人甘髓間充質(zhì)干細胞及其亞群lILA~DRC一kif細胞向肝系細胞分化的實驗研究 材料和方法 骨髓細胞來源于健康志愿者的胸骨，年齡2一35歲。本實驗分兩組:A組:骨髓 間充質(zhì)干細胞組;B組:HLA一DR一C一Kit一細胞組。A組細胞通過密度梯度離心(密度 1.0779/ml)獲得。在細胞達到對數(shù)生長期后傳至第三代時，用流式細胞儀檢測骨髓間充 質(zhì)干細胞的純度。B組細胞為第三代的A組細胞用磁式分離儀分離獲得。以上兩組細胞 在達到對數(shù)生長期之前用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基(低糖)培養(yǎng)，在細胞達到 對數(shù)生長期后開始誘導時，接種于預先鋪有爬片的24孔培養(yǎng)板中，爬片預先用1林g/m1F’N (纖維連接素)處理，用含5%FBS、1 X ITS(胰島素一轉鐵素一硒混合物)、lmg/m1BSA (牛血清白蛋白)、4.7林g/ml亞油酸、10一SM幾地塞米松、10一樹L抗壞血酸、loou/ml 青霉素、100U/m1鏈霉素以及10ng/m1EGF的DF培養(yǎng)基培養(yǎng)，根據(jù)所加生長因子的不 同又各分為四組:HGF(HePatoeyte即o，幾h factor，肝細胞生長因子)組、FoF4(Fibroblast grov改h factor一4，纖維母細胞生長因子一4)組、HGF+FGF4組以及無生長因子組，每組設 12個復孔。 以上各組細胞接種密度為2 xl護/c mZ，分別留取新鮮分離的細胞及各組誘導培養(yǎng) 后O天、7天、14天、21天、28天時的細胞，用免疫細胞化學方法檢測肝系細胞的特 異性標志:CK18、AFP、白蛋白以檢測誘導后的細胞表型，用PAS法進行糖原染色檢 測誘導后的細胞功能，Rl，一PCR法檢測新鮮分離的骨髓細胞中AFP、C一met(HGF受體)、 FGFRZ(FGF4受體)的mRNA表達情況。 統(tǒng)計學分析:各指標的陽性表達情況在不同時間點、不同組、不同處理因素之間的 比較，陽性率以無勺表示，以。=0.05為檢驗水準，用sPsslo.o軟件分析，采用重復測 量數(shù)據(jù)方差分析進行統(tǒng)計。 結果 1密度梯度離心法分離的人骨髓細胞，大小均勻，透亮度好，臺盼藍染色細胞活 率95%。細胞達到對數(shù)生長期后傳至第三代后，用流式細胞儀檢測細胞表面抗原CD29 和CD44，表達率分別為90.6%和91 .5%，說明分離的人骨髓間充質(zhì)干細胞純度較高。 2磁式分離儀所得的HLA一DR一C一擻t一細胞，在倒置顯微鏡下觀察，細胞透亮度 好，臺盼藍染色細胞活率95%。 3人骨髓MSCs24小時內(nèi)貼壁，以后逐漸增多，細胞成克隆性生長，3天時可見 鄭州大學2004年碩士研究生畢業(yè)論文 體外誘導人骨做間充質(zhì)干細胞及其亞群HLA一D玄C一kif細胞向肝系細胞分化的實驗研究 到呈梭形的細胞，10天左右可達到對數(shù)生長期。進行磁式分離后，細胞24小時內(nèi)迅速 貼壁、伸展，增殖迅速，3一4天即可達對數(shù)生長期。 4在細胞培養(yǎng)過程中發(fā)現(xiàn)單用HGF誘導時細胞增殖速度慢，而單用FGF4及聯(lián) 用HGF和FGF4誘導時細胞增殖速度較快。 5新分離的細胞及兩組細胞在誘導0天時均未檢測到肝系細胞的標志，然而用 RT一PCR法可在新分離的骨髓細胞中檢測到AFP以及c一met和FGFRZ mRNA表達。 6兩組細胞用含生長因子的培養(yǎng)基培養(yǎng)后均可檢測到肝系細胞的標志，而不含生 長因子的培養(yǎng)基培養(yǎng)后未檢測到相應標志的表達。 7統(tǒng)計學分析顯示，CK18、AFP、白蛋白以及糖原這四個指標的陽性率在兩組之 間均無明顯差異沙0.05)，在單用HGF、單用FGF4或兩者聯(lián)用時也無明顯差異印0.05)， 各指標的陽性率隨培養(yǎng)時間的變化而有差異印0.01)。 結論 1密度梯度離心法適于分離人骨髓間充質(zhì)干細胞，且活率和
【學位授予單位】：鄭州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2004
【分類號】：R329.2

【參考文獻】

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本文編號：2750731