【摘要】： 目前有關(guān)丙型肝炎疫苗的研究主要集中在兩方面，一是從基礎(chǔ)研究 著手，研究HCV多肽的體液免疫和細胞免疫位點，尋找高突變區(qū)以外的 具有保護作用的保守序列；另一方面是采用小動物模型，進行整體HCV 免疫保護實驗。近年來，這兩方面的研究都取得了顯著進展，使人們逐 漸增加了對成功研制HCV疫苗的信心。 核酸疫苗是將編碼目的抗原的基因插入帶有必要調(diào)控元件的真核表 達載體中，免疫時只需把構(gòu)建好的重組質(zhì)粒接種于機體，機體細胞就會 攝取質(zhì)粒并表達目的抗原，誘導動物免疫系統(tǒng)對編碼序列所表達的蛋白 質(zhì)發(fā)生免疫應答。免疫效果較好，在流感病毒、HIV及HBV等許多病毒 感染性疾病的預防研究中已取得了肯定的結(jié)果。本研究是將核酸疫苗應 用到丙型肝炎的研究中，選用一個真核高效表達載體，以EF-1α作為啟 動子，構(gòu)建了一種能在體外細胞中穩(wěn)定表達HCV C蛋白的核酸疫苗，將 其免疫小鼠，從體液免疫和細胞免疫的角度觀察能否誘導產(chǎn)生較高滴度 的抗體以及針對HCV特異性的CTL反應，從而驗證研制HCV核酸疫苗 的可能性。 方法： 1．核酸疫菌的構(gòu)建：PCR法從PQE HCVc191質(zhì)粒擴增出HCV核心區(qū) 的cDNA，經(jīng)雙酶切法將其定向插入真核表達載體pEF的SaL I和BamH 第四罕醫(yī)大學碩士論文 中文摘要 I位點中，構(gòu)建可在真核細胞中表達HCV C蛋白的核酸疫苗pEF－HCV， 用PCR法和酶切法鑒定所構(gòu)建的重組質(zhì)粒。 2．轉(zhuǎn)染：用脂質(zhì)體介導法將 pEF衛(wèi)CV C重組質(zhì)粒體外轉(zhuǎn)染 BALB／c小 鼠 SPZ／0細胞，用斑點雜交和免疫組化法檢測 SPZ／0細胞內(nèi) HCV C蛋白 的瞬時表達情況和穩(wěn)定表達情況。 3．免疫：根據(jù)不同的免疫次數(shù)、免疫處理方式將所構(gòu)建的核酸疫苗接種 于BALB七小鼠后腿內(nèi)側(cè)肌肉中，ELISA法檢測免疫小鼠血清抗．HCV C 水平。 4．體外CTL活性檢測：于末次免疫后兩周，取出免疫小鼠脾臟，研磨 制備效應細胞，用穩(wěn)定轉(zhuǎn)染 pEF－HCV C重組質(zhì)粒的 SPZ川細胞作靶細 胞，乳酸脫氫酶實驗鑒定CTL活力。 5．體內(nèi) CTL活性檢測：在末次兔疫后四周，取經(jīng)pEF－HCV C重組質(zhì)粒 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的SP2／0細胞，分多點雙脅部皮下注射經(jīng)核酸疫苗4次兔疫的 小鼠，建立荷瘤小鼠模型，觀察腫瘤出現(xiàn)時間、腫瘤大小、腫瘤數(shù)目、 小鼠死亡時間各項指標，并設(shè)立對照組進行觀察比較。 結(jié)果： 1．經(jīng)酶切鑒定和 PCR鑒定，表明核酸疫苗的構(gòu)建正確；將所構(gòu)建的核 酸疫苗轉(zhuǎn)入SP2／0細胞后，可在轉(zhuǎn)染細胞中檢測到HCV C蛋白的穩(wěn)定表 達。 二．以不同的免疫方式、處理方式免疫BALB／c小鼠，觀察到HCV核酸 疫苗可以誘導產(chǎn)生針對HCV的體液兔疫應答；早期滴度較低，隨后抗體 水平呈現(xiàn)上升的趨勢；加強免疫可以提高血清中抗體滴度，處理實驗組 可以刺激產(chǎn)主更高的抗體滴度。 3 第四軍醫(yī)大學項士論文 中文摘要 3．用定量乳酸脫氫酶（LDH）法測定CTL活力，最適效靶比為150： 1，該效靶比下各組 CTL反應平均值：對照組為 16．3％士 8．7％，實驗組 為 72．7％土 6．sl％，經(jīng) t檢驗兩組 CTL活性有顯著差別。 4．荷瘤小鼠產(chǎn)生的腫瘤，在對照組較實驗組出現(xiàn)早，前者腫瘤出現(xiàn)時間 為 15士 4天，后者為 23士 6天；對照組腫瘤生長速度快，死亡時腫瘤一 般＞3＊m：對照組小鼠存活時間較實驗組短，兩組的存活時間分別為4O土 3天和的土6天，各項觀察指標經(jīng)亡檢驗均有顯著差異。 討論： 我們的研究結(jié)果說明構(gòu)建的丙型肝炎核酸疫苗免疫接種BALB兒小 鼠后，能誘導產(chǎn)生針對該表達抗原的體液免疫應答和細胞免疫應答，這 種免疫應答隨著免疫次數(shù)的增加而加強。在觀察穩(wěn)定轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的小 鼠SP2／0細胞對免疫小鼠成瘤性研究中，發(fā)現(xiàn)DNA疫苗可以降低成瘤 率，抑制腫瘤生長，延長小鼠存活期和提高小鼠存活率。另外，體外殺 傷實驗證實，DNA疫苗可以明顯提高小鼠脾細胞的HCV特異性CTL殺 傷率，具有很強的細胞兔疫原性，可以誘導宿主產(chǎn)生明顯的CTLS反 應。這些結(jié)果證實了DNA疫苗的免疫原性及其對體內(nèi)病毒感染的預防和 治療作用，為HCV的核酸疫苗研究提供一些基礎(chǔ)資料。
【學位授予單位】：第四軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2001
【分類號】：R392-33

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 周紅超,徐德忠,張鵬,閆永平,張景霞,趙小寧,朱勇,金伯泉;鑒別HCV C蛋白上HLA-A2限制的CTL識別表位的研究[J];細胞與分子免疫學雜志;1999年01期

2 馮志華,周永興,賈戰(zhàn)生,連建奇,李謹革,李文波;丙型肝炎病毒核心基因免疫誘生細胞免疫應答研究[J];中華內(nèi)科雜志;1999年07期

本文編號：2750021