【摘要】：外傷后細菌性致死性肉芽腫(Fatal bacteria granuloma after truma,FBGT)是一種病程短、致死率高的新疾病，21世紀前還未被皮膚病學界所認識，直至1996年才由西京醫(yī)院皮膚科發(fā)現(xiàn)并命名。 多個病人的皮損行透射電鏡檢查，發(fā)現(xiàn)炎細胞內(nèi)外存在類似短桿菌，將患者皮損組織行多次嚴格的細菌培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)致病菌為一種革蘭陽性厭氧短桿菌，細菌生化鑒定支持本致病菌為痤瘡丙酸桿菌(propionibacteria aches, P.acnes)或放線菌，而API系統(tǒng)鑒定為P.acnes，并且根據(jù)該致病菌藥敏試驗結(jié)果挽救了一例患者。 1．外傷后細菌性致死性肉芽腫致病菌分子生物學鑒定 通常認為P.aches是一種皮膚的常駐菌群，其致病力很低，但在FBGT中可以引起患者死亡，這一點和已知P.acnes特性不符合，隨之出現(xiàn)一個問題，從FBGT皮損中分離出來的致病菌是否確實是P.acnes?雖然API系統(tǒng)鑒定為P.acnes，但該致病菌生化鑒定難以確定其種屬，有必要進行深入研究，明確其分類。 現(xiàn)代微生物學提出的多相分類(polyphasic taxonomy)， 第四軍醫(yī)大學碩士學位論文 包含表型、基因、系統(tǒng)發(fā)育等信息，是研究細菌分類的最有效手 段，其中，165 rRNA序列測定可以判定系統(tǒng)發(fā)育信息，適用于細 菌的各級分類[5]，而DNA一DNA雜交可以確定DNA同源性，是確定 正確分類地位的重要方法〔6]。同樣，這些方法也可以用來對未知細 菌進行鑒定，確定其種屬。 我們對于FBGT皮損中分離出的致病菌進行165 rRNA序列測 定，并將測序結(jié)果在Genebank中進行 Blast分析，與國外報道的P. aeneS16S rRNA序列同源性達到99.9%，確認其為P.acnes。 為了保證結(jié)果準確無誤，我們又進一步委托中國科學院微生 物所將該致病菌和P.acnes標準株進行DNA一DNA雜交，結(jié)果顯 示兩者DNA同源性)70%，可以確定兩者為同一種細菌。 上述實驗證實FBGT患者皮損中分離出的致病菌為P.acnes。 2.外傷后細菌性致死性肉芽腫動物模型初步構(gòu)建 FBGT作為一種感染性疾病，深入研究其發(fā)病機理，探索其治 療措施離不開動物模型的支持，因此構(gòu)建本病動物模型成為深入 研究本病的關(guān)鍵。 構(gòu)建細菌感染動物模型的成功標準，國際上公認的是郭霍定律Iv] (K0ch’ 5 Postulates)，其基本內(nèi)容是:1.微生物只存在于患病的動 物體內(nèi)，在健康動物體內(nèi)不存在;2.微生物必須從動物體內(nèi)分離培養(yǎng) 出來;3.接種純培養(yǎng)微生物到健康動物體內(nèi)可以致病;4.注射微生 物后動物出現(xiàn)病變，再一次分離培養(yǎng)出原來致病菌。 根據(jù)預(yù)實驗結(jié)果，我們選擇家兔進行研究。 采取的實驗方法主要是:首先利用皮質(zhì)激素制造家兔的免疫 抑制狀態(tài)，然后將純培養(yǎng)的對數(shù)生長期致病菌及P.acnes標準 株配制成細菌懸液，注射入家兔皮內(nèi)，觀察注射部位的反應(yīng)及實 驗動物的全身情況。將注射部位出現(xiàn)的皮損分別行組織病理、電 第四軍醫(yī)大學碩士學位論文 鏡檢查及細菌培養(yǎng):并對培養(yǎng)出的細菌行API鑒定及165 rRNA 序列分析，并根據(jù)臨床資料選擇不同類藥物進行藥敏試驗;部分 出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)癥狀的動物及時行MRI檢查，并取其腦組織進行組 織病理、電鏡檢查及細菌培養(yǎng)。 實驗結(jié)果顯示，所有家兔注射部位出現(xiàn)紅斑，注射低濃度(1 x106/mL)細菌的紅斑數(shù)日內(nèi)消失，而注射高濃度(9 xlo勺mL) 細菌導(dǎo)致的紅斑則持續(xù)時間較長，部分發(fā)展為膿腫，可以從皮內(nèi) 膿腫中再一次分離培養(yǎng)出革蘭陽性短桿菌;兩組共5只家兔出現(xiàn) 神經(jīng)系統(tǒng)癥狀(單側(cè)眼球突出或下肢癱瘓等)，其中注射高濃度 標準株的有2只，而注射高濃度P.acnes臨床株的有3只，說 明P.acnes標準株和臨床株均可在家兔身上致病。 注射P.acnes臨床株的家兔有l(wèi)只在初次注射兩周后死亡， 未查明其死亡原因;其余4只出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)癥狀的家兔的背部注 射部位也同樣出現(xiàn)紅斑膿腫，但其頭皮注射部位的紅斑在第一次 注射4周左右逐漸消退，變?yōu)橘|(zhì)地較硬的結(jié)節(jié)，組織病理發(fā)現(xiàn)多 核巨細胞聚集，在一定程度上類似FBGT患者的組織病理結(jié)果; 出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)癥狀的家兔腦組織病理結(jié)果為腦水腫明顯，有較多 淋巴細胞浸潤，但未見多核巨細胞，腦組織未培養(yǎng)出所注射細菌。 從家兔皮損中分離出的細菌傳代分離純菌，行API鑒定及165 rRNA序列測定均符合P.acnes。實驗結(jié)果符合郭霍定律，構(gòu)建成 功FBGT動物模型。 本實驗結(jié)果確認FBGT的致病菌是P.acnes，加深了對FBGT 的認識;并利用家兔構(gòu)建成功FBGT的動物模型，為進一步深入 研究本病的發(fā)病機理打下了一定的實驗動物學基礎(chǔ)，對構(gòu)建更加 完備的動物模型有一定啟示。
【學位授予單位】：第四軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2004
【分類號】：R378
【圖文】：

1.3.1.1165rRNA基因PCR產(chǎn)物提取細菌DNA后，利用所設(shè)計165rRNA引物行PCR擴增，擴增產(chǎn)物行電泳發(fā)現(xiàn)在約1500bp左右出現(xiàn)明顯條帶(圖1一A)，證實提取成功。

一A:注射后1日出現(xiàn)紅斑;

并且注射9x105/mL細菌懸液組部分皮損出現(xiàn)破潰、流膿，但注射lx106/mL細菌懸液組內(nèi)各家兔均未出現(xiàn)破潰流膿。圖2一A:注射后1日出現(xiàn)紅斑;圖2一B:注射后3日，紅斑達到最大，周圍呈浸潤性;

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本文編號：2744785