本文關(guān)鍵詞：脯氨酰寡肽酶過表達(dá)對硫代乙酰胺誘導(dǎo)大鼠肝纖維化模型影響，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的:探討慢病毒介導(dǎo)的脯氨酰寡肽酶(POP)過表達(dá)對硫代乙酰胺誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化模型的影響。方法:從基因庫中獲取大鼠POP基因序列(NM_031324),構(gòu)建攜帶POP基因慢病毒過表達(dá)載體,通過酶切鑒定及測序的方式鑒定陽性質(zhì)粒,采用Western Blot的方法驗證POP蛋白在293T細(xì)胞內(nèi)的表達(dá);以不同劑量的POP慢病毒載體(1.25×10^7TU、2.5×10^7TU和5×10^7TU)轉(zhuǎn)染正常大鼠,另設(shè)相應(yīng)濃度空病毒載體對照(每組n=3,門靜脈注射病毒),注射后2w進(jìn)行肝臟取材,實時定量PCR檢測不同劑量慢病毒轉(zhuǎn)染后肝內(nèi)POP m RNA相對表達(dá)量的差異;以慢病毒(5×10^7TU)轉(zhuǎn)染正常大鼠,分別于注射后1w、2w和3w處死大鼠,用實時定量PCR檢測轉(zhuǎn)染不同時長肝內(nèi)POP m RNA相對表達(dá)量變化。40只雄性SD大鼠隨機(jī)分為4組,采用5%TAA腹腔內(nèi)注射誘導(dǎo)大鼠肝纖維化模型,各組分別在造模第1w末門靜脈注射生理鹽水(正常對照組和TAA模型組)、空病毒(空病毒組,TAA模型+空病毒組)或攜POP慢病毒(POP慢病毒組,TAA模型+POP慢病毒);在造模第4w末,隔夜禁食后次日下腔靜脈取血,處死動物,稱量肝臟濕重,留取肝臟組織;采用蘇木素-伊紅(HE)染色及Masson染色觀察肝臟病理形態(tài)學(xué)及纖維化情況,采用化學(xué)比色法測定肝組織內(nèi)羥脯氨酸含量,采用實時定量PCR檢測肝臟組織POP、單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1)、α平滑肌骨動蛋白(α-SMA)、轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)和Ⅰ型膠原(Col-1)m RNA表達(dá),采用Western Blot法檢測POP、CD68、α-SMA、TGF-β、磷酸化Smad-2蛋白表達(dá)水平,采用免疫組織化學(xué)染色檢測CD68(+)細(xì)胞數(shù)量和分布;采用自動生化儀測定各組大鼠血清生化指標(biāo),包括丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、血清白蛋白(ALB)、總膽紅素(TBIL)。結(jié)果:酶切鑒定及測序結(jié)果均與目的基因吻合,轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后,Western Blot可在293T細(xì)胞內(nèi)檢測到Flag與目的基因融合蛋白;不同劑量的攜POP慢病毒或空病毒轉(zhuǎn)染大鼠2w后,與正常對照組比較,大鼠肝組織內(nèi)POP m RNA表達(dá)在1.25×10^7TU慢病毒組RQ值為0.96,與對照組相比無顯著差異,2.5×10^7TU慢病毒載體組與5×10^7TU慢病毒載體組RQ值分別為1.38和1.3,均顯著高于對照組(P0.01),但2.5×10^7TU組與5×10^7TU組之間無統(tǒng)計學(xué)差異;空病毒載體與正常對照組間POP m RNA無顯著差異。冰凍切片觀察熒光與上述結(jié)果相符。模型組POP蛋白相對表達(dá)量較正常對照組顯著降低(P0.05),而POP慢病毒組POP蛋白水平較其余三組均顯著升高(P0.01),POP m RNA相對表達(dá)變化與POP蛋白相一致;TAA模型組和空病毒組的纖維化評分多為Ⅱ級,肝纖維化半定量積分分別為(15.2±1.69)和(15.3±4.62),顯著高于正常對照組(1.75土0.63)和POP慢病毒組(7.75±2.71)(P0.05);模型組和空病毒組肝組織羥脯氨酸含量分別為(504.47±111.15)μg/g肝質(zhì)量和(498.32±90.87)μg/g肝質(zhì)量,均顯著高于正常對照組【(298.20±47.47μg/g肝質(zhì)量),P0.05】,而POP慢病毒組大鼠肝組織中羥脯氨酸含量為(383.52±43.49μg/g肝質(zhì)量),顯著低于模型組和空病毒組(P0.05);模型組及空病毒組α-SMA m RNA較正常對照組分別升高2~3倍(P0.01),蛋白水升高3~4倍(P0.01),POP慢病毒組大鼠肝組織α-SMA m RNA和蛋白水平較模型組及空病毒組分別降低50%左右和30%~40%(P0.05);與對照組比較,模型組及空病毒組血清AST【(167.21±41.41)U/L,(169.22±31.46)U/L】為對照組的1.4倍【(123.81±23.02)U/L,P均0.05】,模型組及空病毒組的血清ALT【(62.79±10.80)U/L,(59.8±15.85)U/L】、TBIL【(167.21±41.41)μmol/L,(169.22±31.46)μmol/L】為對照組的1.7~3.4倍【(33.67±2.84)μmol/L,(2.56±1.17)μmol/L,P均0.01】,ALB【(20.54±2.02)g/L,(20.19±2.00)g/L】較對照組下降約20%【(25.01±1.77)g/L,P0.01】;POP慢病毒組AST、ALT和TBIL分別為(127.89±32.7)U/L、(41.95±11.75)U/L和TBI(4.28±1.67)μmol/L,較模型組及空病毒組降低約30%~70%(P0.05),ALB為(22.73±1.77)g/L,較正常對照組稍下降(P0.05);模型組及空病毒組較正常對照組MCP-1 m RNA水平均升高4~5倍(P0.01),POP慢病毒組大鼠肝組織MCP-1 m RNA水平較模型組及空病毒組降低50%~60%(P0.05);模型組及空病毒組較正常對照組TGF-βm RNA升高6~8倍(P0.01),蛋白水平均升高1~2倍(P0.01),POP慢病毒組大鼠肝組織TGF-βm RNA較模型組及空病毒組降低40%~50%,蛋白水平降低40%(P0.05);模型組及空病毒組較正常對照組Smad2/3蛋白水平均升高1~2倍(P0.01),POP慢病毒組大鼠肝組織Smad2/3蛋白水平較模型組及空病毒組降低40%~50%(P0.05);模型組CD68陽性細(xì)胞數(shù)為(52.75±21.639)/HP,空病毒組為(54±1.19.5)/HP,均顯著高于正常對照組【(2.66±1.15),P0.01】,而POP慢病毒組為(21±13.45)/HP,較模型組及空病毒組均顯著減少(P0.01)。結(jié)論:構(gòu)建成功的攜POP基因慢病毒能成功在大鼠肝臟內(nèi)實現(xiàn)POP蛋白的持續(xù)過表達(dá);POP肝內(nèi)過表達(dá)能抑制TAA誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化的進(jìn)展,這一過程中伴隨著肝內(nèi)MCP-1等炎癥反因細(xì)胞因子表達(dá)抑制和CD68陽性細(xì)胞數(shù)量下調(diào),以及促纖維化的TGF-β-1-磷酸化Smads2/3信號通路抑制。
【關(guān)鍵詞】：肝纖維化 脯氨酰寡肽酶 慢病毒 過表達(dá) 硫代乙酰胺
【學(xué)位授予單位】：上海交通大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R575.2;R-332
【目錄】：

• 摘要5-8
• ABSTRACT8-15
• 緒論15-17
• 第一部分 慢病毒POP表達(dá)栽體的構(gòu)建及其在大鼠肝內(nèi)轉(zhuǎn)染效率研究17-50
• 1.1 材料與方法17-37
• 1.1.1 材料17-20
• 1.1.2 方法20-37
• 1.2 結(jié)果37-47
• 1.2.1 慢病毒POP表達(dá)栽體構(gòu)建、篩選及體外驗證37-44
• 1.2.2 硫代乙酰胺誘導(dǎo)大鼠肝纖維化模型的建立44-45
• 1.2.3 不同劑量的攜POP慢病毒過表達(dá)載體或空病毒栽體轉(zhuǎn)染大鼠的比較45-46
• 1.2.4 同一劑量慢病毒載體轉(zhuǎn)染大鼠肝臟的不同持續(xù)時間的比較46-47
• 1.3 討論47-50
• 第二部分 慢病毒介導(dǎo)的脯氨酰寡肽酶過表達(dá)對硫代乙酰胺誘導(dǎo)大鼠肝纖維化影響50-68
• 2.1 材料與方法50-58
• 2.1.1 材料50-52
• 2.1.1.1 實驗動物50
• 2.1.1.2 藥物與試劑50-51
• 2.1.1.3 主要儀器51-52
• 2.1.2 方法52-58
• 2.1.2.1 試劑配制52
• 2.1.2.2 動物模型及分組52-53
• 2.1.2.3 體內(nèi)慢病毒轉(zhuǎn)染53
• 2.1.2.4 標(biāo)本采集53
• 2.1.2.5 病理組織學(xué)檢測53-54
• 2.1.2.6 羥脯氨酸含量的測定54-55
• 2.1.2.7 血清檢測55
• 2.1.2.8 樣本RNA提取及檢測55
• 2.1.2.9 樣品蛋白的提取及檢測55-58
• 2.1.2.10 統(tǒng)計學(xué)處理58
• 2.2 結(jié)果58-64
• 2.2.1 攜POP慢病毒過表達(dá)載體體內(nèi)過表達(dá)成功58
• 2.2.2 大鼠肝臟病理學(xué)變化58-59
• 2.2.3 血清學(xué)分析59-60
• 2.2.4 肝臟纖維化指標(biāo)變化60-61
• 2.2.4.1 羥脯氨酸含量的變化60-61
• 2.2.4.2 α-SMA的變化61
• 2.2.5 肝臟內(nèi)炎性指標(biāo)的變化61-63
• 2.2.5.1 肝臟CD68免疫組織化學(xué)染色62-63
• 2.2.5.2 MCP-1 m RNA水平變化63
• 2.2.6 TGF-β/Smad通路的變化63-64
• 2.3 討論64-68
• 2.3.1 脯氨酰寡肽酶與肝纖維化64-65
• 2.3.2 脯氨酰寡肽酶與炎癥反應(yīng)65-67
• 2.3.3 脯氨酰寡肽酶與TGF-β/Smad信號通路67-68
• 結(jié)論68-69
• 參考文獻(xiàn)69-72
• 附錄：綜述72-79
• 參考文獻(xiàn)（References）76-79
• 致謝79-81
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文和題目81

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本文編號：273359