發(fā)布時(shí)間：2020-06-21 00:58

【摘要】：神經(jīng)元特異性烯醇化酶(Neuron-specific enolase ，NSE)是烯醇化酶的一種同工酶。γγ、αγ組成的同工酶為神經(jīng)元和神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞特有，故命名為神經(jīng)元特異性烯醇化酶。NSE基因核苷酸序列全長(zhǎng)2423bp，開(kāi)放讀碼框架從第226到1531個(gè)堿基，長(zhǎng)度為1305bp，編碼全部434個(gè)氨基酸。 目的 本研究的目的是通過(guò)克隆序列正確的人神經(jīng)元特異性烯醇化酶 (NSE) 基因，表達(dá)蛋白，制備出鼠抗人神經(jīng)元特異性烯醇化酶 (NSE)的單克隆抗體，以便為檢測(cè)腫瘤細(xì)胞或組織中NSE抗原提供一種有效的工具。方法 首先利用NSE特異引物，通過(guò)RT-PCR從人肺癌細(xì)胞株A549中擴(kuò)增人NSE分子的cDNA全長(zhǎng)。與pGEM-T載體連接轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，構(gòu)建重組質(zhì)粒pGEM-T-NSE。重組質(zhì)粒測(cè)序鑒定基因序列，然后將NSE基因定向克隆于原核高效表達(dá)載體pMS-31b，轉(zhuǎn)化大腸桿菌POP2136經(jīng)42℃熱誘導(dǎo)獲得MS2-NSE融合蛋白。融合蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳分離、電洗脫 、PBS透析純化后，免疫BALB/C小鼠。應(yīng)用常規(guī)雜交瘤技術(shù)，通過(guò)ELISA雙篩，篩出能分泌抗人NSE單克隆抗體（NSE McAb）的雜交瘤細(xì)胞株并進(jìn)行體內(nèi)培養(yǎng)制備腹水。檢測(cè)其分泌抗體的亞型，據(jù)亞型選擇不同的純化方法純化。然后用細(xì)胞化學(xué)、特異性、Western-blot等方法鑒定制備抗體的免疫反應(yīng)及特異性。以自制的NSE McAb采用IHC技術(shù)檢測(cè)NSE在人肺癌細(xì)胞A549、BE1（高轉(zhuǎn)移）、LH7（低轉(zhuǎn)移）以及肝癌細(xì)胞7402中的表達(dá)。結(jié)果 本研究克隆了人神經(jīng)元特異性烯醇化酶基因，測(cè)序結(jié)果證明克隆的NSE基因序列完全正確，獲得了2株能穩(wěn)定分泌抗NSE單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，制備了抗NSE的單克隆抗體，經(jīng)檢測(cè)其分泌抗體的亞型分別為IgG1和IgG2a。細(xì)胞化學(xué)結(jié)果表明NSE在肺癌細(xì)胞A549、BE1（高轉(zhuǎn)移）、LH7（低轉(zhuǎn)移）以及肝癌細(xì)胞7402中均表達(dá)于胞漿。結(jié)論 本研究制備了抗NSE單克隆抗體，初步檢測(cè)了NSE在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)情況，為以后進(jìn)一步研究NSE的功能奠定了基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：山西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2004
【分類(lèi)號(hào)】：R392
【圖文】：

2 NSE 片段的 RT-PCR 擴(kuò)fragment of human NSE am MW standard: Lambda DNA ET-PCR product of NSE組質(zhì)粒的鑒定結(jié)果經(jīng)瓊脂糖回收后，與 pGEcoRI / XbaI 雙酶切后，，這與載體 pGEM-T 及 N

圖 2 NSE 片段的 RT-PCR 擴(kuò)增gene fragment of human NSE amplific DNA MW standard: Lambda DNA EcoRI+1： RT-PCR product of NSESE 重組質(zhì)粒的鑒定結(jié)果 產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖回收后，與 pGEM-E 經(jīng) EcoRI / XbaI 雙酶切后，在 3A 帶，這與載體 pGEM-T 及 NSE 片

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