【摘要】：目的 為了建立持久穩(wěn)定混合嵌合體(MC)模型及進(jìn)一步探討其對(duì)異種骨髓移植(XBMT)后急性移植物抗宿主病(aGVHD)的防治作用。 方法 1、建立持久穩(wěn)定MC模型：取7天前開始飲用含紅霉素和慶大霉素水4～6周齡SD清潔級(jí)大鼠，接受~(60)Coγ射線7.5Gy全身照射(TBI)后，4小時(shí)內(nèi)行XBMT，即經(jīng)尾靜脈輸注6～8周齡BALB／c(H-2~d)小鼠骨髓細(xì)胞(BMCs)2×10~8／只，2天后，給予腹腔注射環(huán)磷酰胺(Cy)50mg·kg~(-1)誘導(dǎo)耐受大鼠后分2組：A1組是XBMT后第14天、21天及28天尾靜脈輸注無(wú)菌生理鹽水；B1組是XBMT后第14天、21天及28天尾靜脈輸注不同劑量BALB／c小鼠脾細(xì)胞(SCs)。通過測(cè)定小鼠源性細(xì)胞和小鼠皮膚移植物在受體大鼠體內(nèi)植入和存活情況以及混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)(MLR)來(lái)檢測(cè)耐受誘導(dǎo)和維持情況。 2、持久穩(wěn)定MC對(duì)XBTM后aGVHD的防治作用：待上述異種模型形成持久穩(wěn)定MC后，給6～8周齡BALB／c小鼠和C57BL／6小鼠8Gy~(60)Coγ射線致死性TBI后分4組：A2組是給BALB／c小鼠經(jīng)尾靜脈反相輸注A1組嵌合大鼠BMCs和SCs；B2組是給BALB／c小鼠經(jīng)尾靜脈反相輸注B1組嵌合大鼠BMCs和SCs；C2組是給C57BL／6小鼠經(jīng)尾靜脈輸注B1組嵌合大鼠BMCs和SCs；D2組是給BALB／c或C57BL／6小鼠經(jīng)尾靜脈輸注生理鹽水。觀察各組小鼠癥狀體征、生存時(shí)間及病理表現(xiàn)，測(cè)定瀕死A2組及存活B2組嵌合小鼠體內(nèi)大鼠源性細(xì)胞植入情況，并追蹤B2組嵌合率變化情況。 結(jié)果 1、測(cè)定嵌合大鼠外周血中小鼠源性細(xì)胞嵌合情況：通過亞致死TBI+輸注BALB／c小鼠BMCs+腹腔注射Cy+供體淋巴細(xì)胞輸注(DLI)建立持久穩(wěn)定MC大鼠模型后，在最后輸注SCs后60天和120天取大鼠外周血給予熒光單克隆抗體免疫組化后在流式細(xì)胞儀(FCM)測(cè)定，60天時(shí)兩 組均測(cè)得小鼠源性細(xì)胞，Al組為3.98%一10.07%，Bl組為14.31%一 21.94%;120天時(shí)Al組降至0.58%一3.34%，Bl組仍維持14.11%一 24.38%。 2、皮膚移植物存活情況:在最后輸注SCS后45天行皮膚移植，Bl 組嵌合大鼠對(duì)BALB/C小鼠皮膚移植物存活時(shí)間較Al組嵌合大鼠對(duì) BALB/c小鼠皮膚移植物存活時(shí)間延長(zhǎng)，兩者有顯著性差異(只0.01); Bl組嵌合大鼠對(duì)CS了BL/6小鼠皮膚移植物存活時(shí)間明顯縮短，與131組 嵌合大鼠對(duì)BALB/C小鼠皮膚移植物存活時(shí)間有顯著性差異(只0.01)。 3、MLR結(jié)果:在最后輸注SCS后90天和120天，檢測(cè)兩組嵌合大 鼠對(duì)特異供體及Bl組嵌合大鼠對(duì)無(wú)關(guān)第三者M(jìn)LR，90天時(shí)兩組嵌合大 鼠對(duì)特異供體反應(yīng)性均低，差異無(wú)顯著性(乃0.05);120天時(shí)AI組嵌 合大鼠對(duì)特異供體反應(yīng)性升高，而Bl組嵌合大鼠對(duì)特異供體反應(yīng)性仍 低，兩者有明顯差異(只0.01)。Bl組嵌合大鼠對(duì)無(wú)關(guān)供體始終有明顯 反應(yīng)。 4、aGVHD模型癥狀體征表現(xiàn):將上述建立的嵌合大鼠BMCs和SCs 按比例輸注給經(jīng)SGy6OCoY射線致死性TBI的BALB/c小鼠和C57BIJ/6小 鼠，建立aGVHD模型，可見A2組和C2組移植小鼠于15天內(nèi)出現(xiàn)少食、 少動(dòng)、精神萎靡、腹瀉、弓背體位、脫毛和體重驟然減輕等表現(xiàn)，有的 伴耳廓腳掌紅斑、皮膚潰瘍;B2組移植小鼠于24天一26天左右出現(xiàn)_L 述癥狀，遲于AZ組和C2組移植小鼠，且較輕，不伴耳廓腳掌紅斑、皮 膚潰瘍，存活到60天B2組小鼠己無(wú)aGVHD癥狀體征。 5、嵌合體對(duì)aGVHD模型生存期影響:A2組移植小鼠平均生存時(shí)間 (MST)為17天;CZ組移植小鼠MST為16天，AZ組和CZ組移植小鼠 均死于aGVHD;B2組移植小鼠生存時(shí)間為42一1 50+天，且移植后20天、 40天、60天存活率分別為100%、90%和50%，約半數(shù)小鼠死亡，其中死 于aGVHD占死亡者約20%，合并aGVHD和感染占約40%，死于感染占約 40%。BZ組小鼠生存時(shí)間比A2組和C2組小鼠生存時(shí)間延長(zhǎng)，差異有統(tǒng) 計(jì)學(xué)意義(只0.01);A2組和CZ組小鼠生存時(shí)間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意 義(尸習(xí).05)。 6、aGVHD病理表現(xiàn):A2組和C2組移植小鼠表現(xiàn)為皮膚中表皮層或 真皮層內(nèi)可見散在的或條索狀分布的淋巴細(xì)胞浸潤(rùn);肝臟膽小管上皮細(xì) 胞腫脹、肝實(shí)質(zhì)灶性變性壞死，匯管區(qū)淋巴細(xì)胞浸潤(rùn);小腸粘膜不同程 度脫落，固有層或肌層有淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)。B2組移植小鼠病理表現(xiàn)較輕， 皮膚中表皮層或真皮層內(nèi)及小腸粘膜固有層僅可見散在分布的淋巴細(xì) 胞，肝臟膽小管上皮細(xì)胞略腫脹。 7、測(cè)定移植小鼠外周血中大鼠源性細(xì)胞嵌合情況:取小鼠外周血 經(jīng)熒光單克隆抗體免疫組化后在FCM測(cè)定，瀕死A2組小鼠嵌合率約為 97.78%一99.44%，同時(shí)測(cè)得B2組小鼠嵌合率為82.37%~86.95%;存活 到60人BZ組小鼠嵌合率為45、34%一55.94%，150天時(shí)仍維持46.87%一 5;專.6d%。 結(jié)淪 l、首次通過非清髓性預(yù)處理建立了小鼠一大鼠MC模型，此模型可 彌一補(bǔ)通過大鼠~小鼠模型無(wú)法解決的問題。 2、隨著時(shí)一間延長(zhǎng)，經(jīng)誘導(dǎo)產(chǎn)生的嵌合率會(huì)逐漸消失，給rl)Ll能 維持嵌合率，誘導(dǎo)持久特異耐受，說明Dll飛叮成功誘導(dǎo)持久穩(wěn)定MC來(lái) 維持供體特異性異種耐受。 3、持久穩(wěn)定MC能減輕aGVHD癥狀體征和病理?yè)p害，延長(zhǎng)生存時(shí)間， 說明持久穩(wěn)定MC對(duì)aGVHD有防治作用，且此防治作用具有特異性。 月、持續(xù)穩(wěn)定MC誘導(dǎo)aGVI們模型中所含供體源性細(xì)胞與未形成持久 穩(wěn)定MC誘導(dǎo)aGVHD模型中所含供體源性細(xì)胞相比較低，但到一定階
【學(xué)位授予單位】：第一軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2004
【分類號(hào)】：R392

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本文編號(hào)：2718112