【摘要】： 幽門螺桿菌(Helicobacter pylori, Hp)是慢性活動性胃炎和消化性潰瘍的主要病因，與胃惡性腫瘤的發(fā)生也密切相關(guān)，且多數(shù)國家和地區(qū)人群Hp感染率高達50％以上。臨床上常用抗生素治療Hp的感染，但存在再次感染、藥物副作用和費用較高等問題。接種Hp疫苗是預(yù)防和控制Hp感染最為有效的措施，基因工程亞單位疫苗應(yīng)是Hp疫苗研制的主要方向。 鞭毛是Hp定植及持續(xù)感染的首要條件之一，可使Hp在粘性環(huán)境中也表現(xiàn)出很強的移行能力，還能誘導(dǎo)促炎細胞因子IL-8的分泌及增強Hp感染部位的炎癥反應(yīng)。鞭毛蛋白由兩個鞭毛素基因(flaA和flaB)編碼的FlaA、FlaB蛋白多聚體組成。 本文采用高保真PCR從臨床分離菌株HpY06中分別擴增全長的flaA和flaB基因，T-A克隆測序后構(gòu)建原核表達系統(tǒng)pET32a(+)-flaA-BL21DE3和pET32a(+)-flaB-BL21DE3，用不同濃度的IPTG誘導(dǎo)FlaA、FlaB融合蛋白表達，SDS-PAGE檢測FlaA、FlaB融合蛋白分子量，并用western blot、免疫雙擴散試驗和ELISA試驗證實了融合蛋白的抗原性和免疫反應(yīng)性。其產(chǎn)物將作為Hp基因工程疫苗及診斷試劑盒的抗原。 實驗方法 1．幽門螺桿菌的培養(yǎng)： 將本室保存的HpY06、HpNCTC11637菌株涂布于Hp選擇性平板培養(yǎng)基上，微需氧環(huán)境37℃培養(yǎng)5d，凡能在Hp選擇性培養(yǎng)基上生長、針尖樣透明菌落、革蘭氏陰性細小彎曲桿菌、快速尿素酶試驗陽性、氧化酶試驗陽性、能與Hp全菌抗體 浙江大學(xué)碩士學(xué)位論文 梁韶暉 發(fā)生凝集者鑒定為HP。 2．幽門螺桿菌模板DNA制備： 采用常規(guī)的苯酚一氯仿法提取 Hp Y06、HpNCTCll637株 DNA，經(jīng)無 DNA酶的 RNA酶消化后，再次用苯酚一氯仿法提取的DNA溶于TE緩沖液中，用分光光度法 測定DNA的濃度和純度。 3．PCR擴增： 根據(jù)HP flPA和 flaB參考核昔酸序列和表達載體克隆位點內(nèi)切酶圖譜分析結(jié) 果，自行設(shè)計引物，由上海博亞生物技術(shù)有限公司（BioAsia）合成。 FlaA基因引物序列女下：上游5’－CC－TGGCTTTTCAGGTCAA－3’（EC。R V）， 下游 5’－CC－AACTAAGTTAAAAGCC－3‘（Xh。I）。 FI＊基因引物序列如下：上游 5’－CCGGAATTCATGAGTTTTAGGATAAA－3‘（Ec。RI）， 下游 5‘－CC－TGTTATTGTAAAAGCC－3‘（Xh。I）。 采用上海博彩生物科技有限公司（BBST）Pfu－Taq混合高保真PCR試劑盒擴增門、 flaB基因，PCR反應(yīng)總體積為 100卜1，引物濃度為 250 nmol／L，100 ng DNA模板。 PCR反應(yīng)參數(shù)：94C5min，XI；94C305，52C305，72t90s，X 10；94oC305， 52oC305，72C1005（以后每循環(huán)增加 105），X15；72’C10min，XI。1．5％的瓊脂 糖凝膠電泳檢測擴增產(chǎn)物。 4．T十克隆、測序與表達載體的構(gòu)建： 采用BBST公司的T七克隆試劑盒將擴增的目的片段克隆至pUCm刁載體中， 轉(zhuǎn)化于巳 col DH 5 a株并擴增，堿變性法提取質(zhì)粒。獲得滿意的測序結(jié)果后，分 別擴增含 pUCm－T－fi8A、pUClllT－f18B和 pET32。（＋）的【。。h DH 5 Q，提取質(zhì)粒 后用雙酶切獲得目的基因片段與pET32a卜）連接后轉(zhuǎn)化于E．colt BLZIDE3，擴增、 提取質(zhì)粒后再次測序，并分別與報道的3個flaA基因核苦酸序列州， NC000921，X60746）和4個flaB基因核苦酸序列（NC00091，NC000921，L08907， AF479024）進行同源性比較。 5．重組蛋白表達與純化： pET32a （＋）fla－BLZIDE3和pET32a（＋廠flaB－BL21DE3分別在含1．0、0．5和 2 浙江大學(xué)碩士學(xué)位論文 梁韶暉 0．1。OI／L IPTG的n培養(yǎng)基中震蕩培養(yǎng)，誘導(dǎo)溫度為37’C；IPTG誘導(dǎo)產(chǎn)物用 超聲波破碎，5000 r／min4t離。G’ 10 min后分別取上清和沉淀：采用 8％ SDS－PAGE 檢查目的蛋白的表達情況。用 NTA親和層析法（BBST）收集表達的目的蛋白。 6．重組蛋白免疫反應(yīng)性和杭原性研究： 以兔抗Hp全菌抗體＊）為一抗、HRP標(biāo)記的羊抗兔IgGUackson Immuno Research）為H抗，用western bolt檢狽重組＊毗和FlaB 蛋白的免疫反應(yīng)性。 用 NTA親和層析法mBST）收集表達的目的蛋白免疫家兔，用免疫雙擴散試驗檢 測重組FlaA、FlaB蛋白的抗原性。 7．EL SA檢測 20 u a加 重組 FlaA、FlaB分另包被酶標(biāo)板，以 1：400稀釋的患者血清為一抗、 HRP標(biāo)記的羊抗人 IgG為二抗、鄰苯二胺為底物，顯色后用酶聯(lián)免疫檢測儀檢測 490urn的吸光值，超過5份陰性血清平均OD值＋3標(biāo)準(zhǔn)差者為陽性。用蛋白含量為 50 n a加 的 Hm臨床菌株純培養(yǎng)物超聲破碎上清包被酶標(biāo)板，以兔抗重組蛋白 FlaA 或FlaB抗體為一抗、HRP標(biāo)記的羊抗兔均G為h抗、鄰苯H胺為底物，顯色后用 酶聯(lián)免疫檢測儀檢測490urn的吸光值，超過5份相同包被濃度的大腸桿菌 ATCC25922陰性對照平均OD值用標(biāo)準(zhǔn)差者為陽性。 結(jié) 果 1．PCR 從Hp Y06株DNA模板中獲得預(yù)期大刁的flaA（1533b）和flaB（1545hp）擴 增條帶。 二．核苦酸序列分析：
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2003
【分類號】：R346
【圖文】：

⑦用TBST漂洗10min(室溫搖床上搖動)，共3次(換漂洗液)。⑧將膜以ECL(A、B液各sml混勻)溫育1min后，用X光片曝光并顯影定影。(圖10、11)

70KD~1andZ:FlaAfosionProteins圖10兔抗Hp全菌抗體與rlaA融合蛋Figure10城sternblotresultofrabbitanteellofHPyloriandFlaAfusion

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2 陳U

本文編號：2716586