發(fā)布時(shí)間：2020-06-14 19:40

【摘要】： 目的： 原肌球蛋白(Tropomyosin，TM)是肌肉收縮過程中的一種調(diào)節(jié)蛋白。本課題將基因重組的人平滑肌TM的同源體-β(hsmTM-β)表達(dá)于人冠狀動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(CASMC)中，旨在探討TM對(duì)血管平滑肌細(xì)胞(VSMC)游走能力的影響，為探索平滑肌中原肌球蛋白的作用開辟新徑。 方法與結(jié)果： 一．基因重組hsmTM-β 采用套式PCR技術(shù)，從人主動(dòng)脈cDNA文庫中擴(kuò)增hsmTM-β的cDNA目的基因片段，用dGTP和T4 DNA聚合酶修飾；在逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pLIB基礎(chǔ)上正向插入AS-RI-Nru片段構(gòu)建載體pLIB-AS，用限制性內(nèi)切酶NruⅠ和EcoRI消化。目的基因和載體經(jīng)酚氯仿抽提，鹽乙醇沉淀純化后，用GENECLEAN Turbo核酸純化試劑盒從瓊脂糖膠中提純DNA，最后在DNA連接酶作用下，將hsmTM-β的cDNA反插入pLIB-AS中，獲得重組質(zhì)粒pLIB-AS-hsmTM-β。用熱休克法將重組DNA轉(zhuǎn)化入感受態(tài)大腸桿菌XL10-Gold中，重組質(zhì)粒按質(zhì)粒的小規(guī)模制備的堿裂解法提取和純化后，用限制性內(nèi)切酶EcoRI驗(yàn)證其全長(zhǎng)，用PCR方法驗(yàn)證其插入片段。結(jié)果顯示用反插入法可以實(shí)現(xiàn)hsmTM-β的基因重組。借助DNA SIS軟件分析人平滑肌TM和雞平滑肌TM的cDNA核苷酸序列，發(fā)現(xiàn)二者同源性達(dá)84.7％。 二．hsmTM-β重組體的轉(zhuǎn)染和表達(dá) 參照逆轉(zhuǎn)錄病毒基因的轉(zhuǎn)染和表達(dá)使用手冊(cè)，在DMEM和SmBM細(xì)胞培養(yǎng)液中分別培養(yǎng)人胚腎細(xì)胞(AmphoPack-293)和人冠狀動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(CASMC)至第三代，用CalPhos~(TM)哺乳類轉(zhuǎn)染試劑盒，將hsmTM-β重組質(zhì)粒pLIB-AS-hsmTM-β和含有增強(qiáng)綠色熒光蛋白(EGFP)cDNA的重組質(zhì)粒pLIB-EGFP分別轉(zhuǎn)染進(jìn) AnlphoPack一293中，產(chǎn)生逆轉(zhuǎn)錄病毒，然后感染CAsMC使基因表達(dá)。用chariot 蛋白轉(zhuǎn)染試劑盒將雞胃平滑肌原肌球蛋白(gTM)轉(zhuǎn)染進(jìn)hsmTM一p/AS反義表達(dá)組 細(xì)胞中。蛋白表達(dá)用Westem Blot法檢測(cè)。 三.WestemBlot分析 從CASMC中獲取胞質(zhì)蛋白，經(jīng)12.5%SDS一AGE電泳后，將蛋白轉(zhuǎn)至PDVF 膜上，用Westem blot法分析TM表達(dá)。PDV下膜用5%脫脂奶粉封閉液過夜后， 以兔抗原肌球蛋白多克隆抗體為一抗(l:1000)，抗兔免疫球蛋白抗體為二抗 (1: 5000)，結(jié)果顯示以純gTM為標(biāo)準(zhǔn)，與對(duì)照組和EGFP表達(dá)組相比，基因重組后 的hsmTM一p表達(dá)敲除。在hamTM一p/AS反義表達(dá)組細(xì)胞補(bǔ)充了gTM后表達(dá)平滑 肌原肌球蛋白(s mTM)，并隨gTM蛋白轉(zhuǎn)染量增多smTM表達(dá)增多。 四.VSMC游走測(cè)定 用Boyden’5 Ch田刀ber方法測(cè)定vSMC的游走，聚碳酸鹽濾過膜使用前以 0.01%I型膠原包被。培養(yǎng)的CASMC細(xì)胞以2 xl護(hù)/ml的密度經(jīng)胰蛋白酶消化后懸 于游走細(xì)胞培養(yǎng)液DMEM(含0.4%BSA)中。于Ch田刀ber的上室加感染不同質(zhì)粒的 CASMC;下室加含有PDGF一BB和不含有PDGF一BB游走細(xì)胞培養(yǎng)液。將Chamber 移至二氧化碳孵箱中，37oC孵育5小時(shí)。隨機(jī)選取四個(gè)400X高倍視野(4H衛(wèi)F)內(nèi) 游走細(xì)胞平均數(shù)評(píng)估細(xì)胞游走能力。 在PDGF一BB趨化劑刺激下，與對(duì)照組和EGFP表達(dá)組相比，單純hsmTM一p/AS 反義表達(dá)組細(xì)胞游走能力明顯增強(qiáng)(P005)。細(xì)胞的隨機(jī)游走能力在hemTM一p基 因敲除時(shí)同樣增強(qiáng)(P0.05)。在hsmTM一側(cè)AS反義表達(dá)組細(xì)胞補(bǔ)充gTM之后， hsmTM一p基因敲除對(duì)細(xì)胞游走的刺激作用消失口0.05)。 結(jié)論 人平滑肌TM一p和雞胃平滑肌TM一p的cDNA核昔酸序列的同源性達(dá)84.7%。 反插入法可實(shí)現(xiàn)hsmTM一p的基因重組，westem blot證實(shí)hsmTM基因敲除。 Boyden’s Chamber法測(cè)定平滑肌細(xì)胞游走，在PDGF一BB趨化劑下和細(xì)胞隨機(jī)游走 下hsmTM一p基因敲除后CASMC的游走能力均增強(qiáng)。
【學(xué)位授予單位】：大連醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2003
【分類號(hào)】：R337
【圖文】：

pLIB一AS經(jīng)Eco砒消化產(chǎn)生117bp和47bp兩個(gè)片段和164bP的未消化片斷。若AS一班一Nru片段是反向插入pLIB中，將產(chǎn)生137bp和27bp兩個(gè)片段，若AS一RI~Nru片段是正向插入pLIB中，產(chǎn)生的片斷應(yīng)與pLIB一AS的情況一致。如圖1.4所示可見，樣本2是篩選出的正向插入pLIB中的所要構(gòu)建的pLIB一AS。PLIBpL田M一AS12345;::。爭(zhēng)…，5.skb4.7kb嚼.留祥:嶺州瓤圖1.5示hsmTM一p重組體經(jīng)限制性內(nèi)切酶EcO人了切割在0.7%瓊脂糖電泳上的結(jié)果。pLIB一s是對(duì)照，樣本有10個(gè)。M是IKb的標(biāo)準(zhǔn)分子量。

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【引證文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 烏云娜;莎麗娜;格日勒?qǐng)D;;高壓處理對(duì)牛骨骼肌原肌球蛋白結(jié)構(gòu)的影響[J];食品工業(yè)科技;2012年03期

本文編號(hào)：2713260