【摘要】：細(xì)胞的增殖狀態(tài)決定著組織的修復(fù)速度，因此，研究應(yīng)激狀態(tài)對(duì)細(xì)胞增殖的影響對(duì)進(jìn)一步了解創(chuàng)傷后組織修復(fù)的啟動(dòng)機(jī)理有著重要的意義。熱應(yīng)激是研究細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)最常使用的模型，，主要優(yōu)點(diǎn)是條件容易控制，穩(wěn)定性好，可重復(fù)性好，因此在本中被采用。 血管內(nèi)皮細(xì)胞(VECs)目前已被視為創(chuàng)傷、休克、感染、心血管疾病、腫瘤和急性肺損傷等多種疾病中最易受損的細(xì)胞，是許多疾病發(fā)生發(fā)展的病理基礎(chǔ)之一。創(chuàng)傷組織的修復(fù)需要內(nèi)皮細(xì)胞增殖和分化的相互協(xié)調(diào)來發(fā)揮作用。目前對(duì)應(yīng)激條件下內(nèi)皮細(xì)胞增殖能力的改變以及通過何種途徑調(diào)節(jié)這種改變還不清楚。 分化抑制因子(Id)家族是參與細(xì)胞增殖與分化的關(guān)鍵蛋白,該蛋白的增殖調(diào)節(jié)作用已在多種細(xì)胞、組織得到證實(shí)。但在VECs的調(diào)控作用還未見報(bào)導(dǎo),尤其對(duì)新近發(fā)現(xiàn)的Id1的上游分子－鈣/鈣調(diào)素依賴的絲氨酸激酶(CASK)在內(nèi)皮細(xì)胞應(yīng)激后的增殖調(diào)控及相關(guān)通路還不清楚。因此本實(shí)驗(yàn)以熱應(yīng)激為模型研究應(yīng)激對(duì)VECs增殖的影響及Id1介導(dǎo)的相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制,并初步研究Id1的上游分子CASK的增殖調(diào)節(jié)作用及涉及的調(diào)節(jié)通路。 實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?. 觀察熱應(yīng)激對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞增殖能力的影響及其相關(guān)信號(hào)通路。 2. 初步研究CASK信號(hào)對(duì)細(xì)胞增殖的影響。 材料和方法：1) 細(xì)胞培養(yǎng)： ECV304細(xì)胞培養(yǎng)基為完全 M199添加10％小牛血清，37℃、5％CO2 孵箱培養(yǎng)，2-3天傳代；2) 3H-TdR摻入法：43℃(或37℃對(duì)照)處理ECV304細(xì)胞2小時(shí)后,96孔板內(nèi)每孔加入3H-TdR0.5uCi,按不同時(shí)相提取細(xì)胞,PBS洗滌3次,消化后用多道細(xì)胞收集儀將細(xì)胞收集在玻璃纖維紙上,晾干,加入閃爍液,分別測定液閃記數(shù)；3) 蛋 WP=9 白免疫印跡（Western Blotting）：接種ECV304細(xì)胞于Φ60mm培養(yǎng)皿中，43℃(或37℃對(duì)照)2小時(shí)處理后于不同時(shí)相點(diǎn)，或者CASK強(qiáng)制表達(dá)ECV304細(xì)胞經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后(或非誘導(dǎo)細(xì)胞作對(duì)照)，用M-PERTM蛋白提取液收集細(xì)胞總蛋白,BCA法定量后經(jīng)SDS-PAG電泳,電轉(zhuǎn)膜，加入相應(yīng)抗體,免疫反應(yīng)條帶用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法（ECL）顯示；4) 強(qiáng)制表達(dá)細(xì)胞株的建立: 按陽離子脂質(zhì)體LipofectAMINE介導(dǎo)的方法轉(zhuǎn)染CASK插入質(zhì)粒pOPRSVI-CASK和其調(diào)控質(zhì)粒pCMVLacI。轉(zhuǎn)染72小時(shí)后，加入含400ug/ml G418和400ug/ml潮霉素（Hygromycin）的M199選擇培養(yǎng)液，連續(xù)篩選5周以上，至出現(xiàn)陽性克隆后將G418濃度降為100ug/ml、潮霉素降為50ug/ml持續(xù)篩選以保持陽性克隆的純度。用25ug/ml絲裂霉素（mitomycinC）處理原代人胎成纖維細(xì)胞制成飼養(yǎng)單層，培養(yǎng)擴(kuò)增陽性單克隆細(xì)胞。5) 免疫熒光細(xì)胞化學(xué)方法: ECV304細(xì)胞及誘導(dǎo)(IPTG4mM,10小時(shí))后的ECV304-CASK細(xì)胞以5×104/皿細(xì)胞數(shù)培養(yǎng)于24孔培養(yǎng)板內(nèi), 加4%福爾馬林浸透固定于玻片。用10%小牛血清封閉后加入CASK與ID1抗體,孵育過夜,加熒光素FITC和Texas red分別標(biāo)記的相應(yīng)二抗染色60分鐘,37℃。1%sPBS洗兩次后置激光共聚焦顯微鏡(LEICA,TCS-NT165 123)觀察CASK與Id1的表達(dá)。6) 細(xì)胞增殖能力分析（細(xì)胞計(jì)數(shù)法）:將CASK穩(wěn)定強(qiáng)制表達(dá)的ECV304細(xì)胞培養(yǎng)于24孔培養(yǎng)板(密度以20%左右為宜),以IPTG 4mM誘導(dǎo)10小時(shí)后(以非誘導(dǎo)細(xì)胞為對(duì)照),連續(xù)計(jì)數(shù)觀察5天。以培養(yǎng)時(shí)間為橫軸,細(xì)胞數(shù)為縱軸,繪制細(xì)胞生長曲線。 結(jié)果：1) 熱應(yīng)激可使ECV304細(xì)胞ICAM-1蛋白表達(dá)增強(qiáng)，說明該熱應(yīng)激模型可激活內(nèi)皮細(xì)胞。 2) 受熱43℃, 2小時(shí)，ECV304細(xì)胞的增殖受到抑制。3H-TdR摻入實(shí)驗(yàn)顯示從熱應(yīng)激后12小時(shí)起實(shí)驗(yàn)組的3H-TdR摻入cpm值顯著低于對(duì)照組，且一直持續(xù)至48小時(shí)(P0.05)。兩次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)均表明熱應(yīng)激可抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的3H-TdR摻入量,因而具有增殖抑制作用。 3) 應(yīng)激后Id1蛋白表達(dá)逐步減弱與P16、P21的表達(dá)逐步增強(qiáng)呈相反趨勢。正常ECV304細(xì)胞的Id1蛋白基礎(chǔ)表達(dá)較高,在受熱后呈緩慢的減弱, 熱 WP=10 刺激后12小時(shí)減弱明顯，至48小時(shí)基本消失。與此相反,P16、P21的表達(dá)呈逐漸增強(qiáng)的趨勢,二者達(dá)到高峰的時(shí)相基本一致。這些結(jié)果提示熱應(yīng)激可激活ECV304細(xì)胞,引起Id1信號(hào)通路的變化,繼而可能引起增殖相關(guān)的基因?qū)ρ軆?nèi)皮細(xì)胞的生長抑制。 4) 成功構(gòu)建了CASK強(qiáng)制表達(dá)的血管內(nèi)皮細(xì)胞株(CASK-ECV304) 。通過蛋白免疫印跡方法測定轉(zhuǎn)染純化的單克隆細(xì)胞的CASK表達(dá),證明這些轉(zhuǎn)染細(xì)胞在IPTG 4mM誘導(dǎo)10小時(shí)可獲得CASK的強(qiáng)陽性表達(dá),其表達(dá)強(qiáng)度與非誘導(dǎo)的對(duì)照細(xì)胞相比有顯著差異(p0.01)。 5) 免疫熒光細(xì)胞化學(xué)分析，觀察CASK與Id1的細(xì)胞內(nèi)定位，發(fā)現(xiàn)二者在正常ECV304細(xì)胞均定位于胞漿；CASK強(qiáng)制表達(dá)的ECV304細(xì)胞中見CASK的表達(dá)在胞漿處明顯增強(qiáng)。提示CASK與Id1在血管內(nèi)皮細(xì)胞中可能存在相互作用,CASK可能通過Id1參與了內(nèi)皮細(xì)胞的增殖調(diào)控。 6) 細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果顯示強(qiáng)制表達(dá)CASK的ECV304細(xì)胞株的增殖受抑制。CASK強(qiáng)制高表達(dá)的ECV304細(xì)胞的增殖滯后于CASK正常表達(dá)細(xì)胞,這種增殖抑制現(xiàn)象出現(xiàn)早,在IPTG誘導(dǎo)后第2天即有明顯差異(p0.01),且一直持續(xù)至第5天。繪制細(xì)胞生長曲線發(fā)現(xiàn),CASK-ECV304細(xì)胞的增殖曲線較對(duì)照組平緩,增殖能力明顯低于對(duì)照組。觀察到第5天差距仍然明顯。 結(jié)論：熱應(yīng)激43℃,2小時(shí)可激活血管內(nèi)皮細(xì)胞株ECV304的ICAM-1表達(dá),使血管內(nèi)皮細(xì)胞的生物學(xué)性狀發(fā)生變化，通過Id1信號(hào)通路上調(diào)增殖負(fù)調(diào)控基因（P16、P
【圖文】：

ASK 的相關(guān)信號(hào)分子及其作用機(jī)制ASK 與神經(jīng)突觸蛋白 和另一 PDZ 蛋白 PSD95 以 PDZ 分別在突觸膜兩側(cè)與 neurexgin 結(jié)合，參與突觸連接的形成[16]。neurexin 是特異地存在于經(jīng)元的高度多形膜蛋白，它與另一類神經(jīng)細(xì)胞膜受體neurolig觸連接。CASK 不但可幫助形成突觸結(jié)構(gòu)，還能由其 SH3 介N 型鈣離子通道結(jié)合[17]。此外，Butz 等[18]發(fā)現(xiàn) CASK 通過 PD的同時(shí)，還能以 PDZ以外的多個(gè)結(jié)構(gòu)域（如 CaMK）連接其白---Mint1 和 Velis, 其中 Mint1 結(jié)合囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 Munc18-1用;Velis 與 LET-23 受體酪氨酸激酶（RTK）結(jié)合，激活 RT Ras 信號(hào)通路。因此這個(gè) PDZ 蛋白三聚體依靠 PDZ 的偶聯(lián)轉(zhuǎn)導(dǎo)與膜轉(zhuǎn)運(yùn)聯(lián)系組織起來。SK 與 syndecans 的作用[12]
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2002
【分類號(hào)】：R363

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 李敏;細(xì)胞因子與熱應(yīng)激和熱適應(yīng)[J];中華勞動(dòng)衛(wèi)生職業(yè)病雜志;1998年02期

2 王麗娜,張偉華,李全鳳,徐長慶;熱應(yīng)激預(yù)適應(yīng)對(duì)H_2O_2誘發(fā)乳鼠心肌細(xì)胞損傷的保護(hù)作用[J];哈爾濱醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào);2003年01期

3 錢令嘉，程素琦，吳孟平，陳西京，張林;熱應(yīng)激大白鼠心肌鈣調(diào)素含量與鈣代謝的研究[J];中華勞動(dòng)衛(wèi)生職業(yè)病雜志;1995年01期

4 趙亞麗,邢成,呂志忠,王魯明,李建棟,趙永岐;熱應(yīng)激對(duì)大鼠紋狀體多巴胺介導(dǎo)的磷脂酰肌醇信號(hào)系統(tǒng)的影響[J];航天醫(yī)學(xué)與醫(yī)學(xué)工程;2001年02期

5 宋學(xué)立,錢令嘉,李鳳芝,弓景波;bcl-2基因轉(zhuǎn)染對(duì)熱應(yīng)激心肌細(xì)胞保護(hù)作用的機(jī)制探討[J];中國應(yīng)用生理學(xué)雜志;2002年04期

6 周愛軍,羅海吉;熱應(yīng)激對(duì)胸腺的損傷及精氨酸的保護(hù)作用[J];國外醫(yī)學(xué).衛(wèi)生學(xué)分冊;2004年06期

7 吳建明,吳包金,林子豪,倪燦榮,劉麒;熱應(yīng)激預(yù)處理加強(qiáng)皮瓣組織存活的作用及其與HSP_(70)合成的關(guān)系[J];第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào);2005年01期

8 湯平濤,王瑞波,吳廣林,賀涵貞,張國高;熱應(yīng)激大鼠肝線粒體,微粒體脂質(zhì)過氧化與 Ca~(2+),Mg~(2+)-ATP 酶的變化[J];中國藥理學(xué)與毒理學(xué)雜志;1997年02期

9 錢令嘉,程素琦,吳孟平,陳西京;熱應(yīng)激大鼠心肌鈣代謝的變化及其機(jī)理探索[J];中國應(yīng)用生理學(xué)雜志;1998年02期

10 李敏,趙法O,郭俊生,李正銀;“生脈飲”對(duì)熱應(yīng)激大鼠血漿鋅、銅、鐵等微量元素含量的影響[J];衛(wèi)生研究;2000年01期

相關(guān)會(huì)議論文 前10條

1 余冰;張克英;陳代文;;AMPK在仔豬體內(nèi)的分布及熱應(yīng)激對(duì)AMPK活性的影響[A];中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)動(dòng)物營養(yǎng)學(xué)分會(huì)——第九屆學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2004年

2 張錦輝;李中文;賈志君;胡茂穎;林新;陳忠;;產(chǎn)前熱應(yīng)激對(duì)仔鼠生殖腺GABA受體發(fā)育的影響[A];畜牧業(yè)環(huán)境、生態(tài)、安全生產(chǎn)與管理——2010年家畜環(huán)境與生態(tài)學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2010年

3 徐向東;程興仁;滕金山;;熱應(yīng)激與個(gè)人防護(hù)[A];第二屆全國人—機(jī)—環(huán)境系統(tǒng)工程學(xué)術(shù)會(huì)議論文集[C];1995年

4 尹小平;袁慧;張明;;奶牛熱應(yīng)激及對(duì)免疫影響的研究進(jìn)展[A];2003全國家畜內(nèi)科學(xué)學(xué)術(shù)研討會(huì)論文專輯[C];2003年

5 褚耀誠;劉鳳華;許劍琴;;清涼沖劑對(duì)不同環(huán)境溫度下豬血清中NO含量的影響[A];第一屆中國養(yǎng)豬生產(chǎn)和疾病控制技術(shù)大會(huì)——2005中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)學(xué)術(shù)年會(huì)論文集[C];2005年

6 張凡建;王金秋;岳圓;侯引緒;王九峰;;日糧添加有機(jī)鉻對(duì)中度熱應(yīng)激奶牛生理生化指標(biāo)的影響研究[A];中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)家畜內(nèi)科學(xué)分會(huì)第七屆代表大會(huì)暨學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集（下冊）[C];2011年

7 張書霞;華榮虹;鮑恩東;;熱應(yīng)激對(duì)雞免疫器官細(xì)胞凋亡的影響及其調(diào)節(jié)機(jī)理[A];中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)獸醫(yī)病理學(xué)分第12次暨中國動(dòng)物病理生理學(xué)專業(yè)委員會(huì)第11次學(xué)術(shù)討論會(huì)論文集[C];2003年

8 王勝林;方智;;豬的熱應(yīng)激及營養(yǎng)調(diào)控的研究進(jìn)展[A];豬營養(yǎng)與飼料研究進(jìn)展——第四屆全國豬營養(yǎng)學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2003年

9 馮英;田真;高繼偉;曹凱軍;何志清;;奶牛熱應(yīng)激與牛舍的設(shè)計(jì)和建造[A];中國奶業(yè)協(xié)會(huì)年會(huì)論文集2008（上冊）[C];2008年

10 王建平;;熱應(yīng)激奶牛瘤胃液中溶纖維丁酸弧菌的含量[A];《第六屆中國牛業(yè)發(fā)展大會(huì)》論文集[C];2011年

相關(guān)重要報(bào)紙文章 前10條

1 晨疆;夏季須防豬熱應(yīng)激[N];福建科技報(bào);2004年

2 李崇婕;緩解家禽熱應(yīng)激的措施[N];中國畜牧水產(chǎn)報(bào);2001年

3 山東省東平縣 李巧云;減輕雞熱應(yīng)激的飼料添加劑[N];河北農(nóng)民報(bào);2005年

4 馮雪;肉雞熱應(yīng)激的緩解措施[N];陜西科技報(bào);2009年

5 鄭州牧專教授 朱士仁;夏季養(yǎng)鵝要防熱應(yīng)激[N];河南科技報(bào);2006年

6 胡財(cái)旺;豬熱應(yīng)激導(dǎo)致營養(yǎng)不良的診治[N];江蘇農(nóng)業(yè)科技報(bào);2009年

7 山西恒豐強(qiáng)動(dòng)物藥業(yè)有限公司技術(shù)部 屈仁健;夏季豬熱應(yīng)激防治小結(jié)[N];中國畜牧獸醫(yī)報(bào);2007年

8 天福萊技術(shù)部;夏季需防產(chǎn)蛋雞熱應(yīng)激[N];中國畜牧報(bào);2004年

9 梁占學(xué) 吳國清 程志學(xué);蛋雞熱應(yīng)激的飼養(yǎng)管理[N];中國畜牧獸醫(yī)報(bào);2009年

10 侯增海 郭煥新;熱應(yīng)激對(duì)母豬的影響及應(yīng)對(duì)措施[N];中國畜牧報(bào);2004年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 王立志;熱應(yīng)激對(duì)奶牛、奶山羊體內(nèi)內(nèi)毒素含量的影響及緩解熱應(yīng)激的營養(yǎng)技術(shù)研究[D];四川農(nóng)業(yè)大學(xué);2010年

2 韓愛云;熱應(yīng)激對(duì)肉雞淋巴細(xì)胞鈣信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的影響及鉻的調(diào)控作用[D];中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2010年

3 李守軍;肉雞急性熱應(yīng)激損傷及其機(jī)理的研究[D];中國農(nóng)業(yè)大學(xué);2005年

4 李靜;37℃持續(xù)熱應(yīng)激對(duì)肉雞血流動(dòng)力學(xué)和酸堿平衡的影響[D];中國農(nóng)業(yè)大學(xué);2004年

5 張大江;經(jīng)導(dǎo)管肝動(dòng)脈熱碘油栓塞治療原發(fā)性肝癌機(jī)理研究[D];復(fù)旦大學(xué);2003年

6 蘇踴躍;CASK-Id1信號(hào)通路在細(xì)胞增殖中的作用[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2004年

7 杜立銀;熱應(yīng)激對(duì)小鼠附植前早期胚胎發(fā)育影響的研究[D];東北農(nóng)業(yè)大學(xué);2005年

8 李守軍;熱休克對(duì)牛卵母細(xì)胞和IVP胚胎影響的研究[D];東北農(nóng)業(yè)大學(xué);2001年

9 朱家橋;DNA甲基化在多囊卵巢綜合征和熱應(yīng)激中的變化及作用[D];甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué);2008年

10 胡長平;辣椒素受體介導(dǎo)吳茱萸次堿的降壓和心臟保護(hù)作用[D];中南大學(xué);2003年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 羅曉鳳;熱應(yīng)激對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的影響及CASK增殖信號(hào)通路的研究[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2002年

2 李峰;熱應(yīng)激對(duì)軸索損傷保護(hù)機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2004年

3 龔遠(yuǎn)英;肉雞急性熱應(yīng)激損傷與應(yīng)激損傷機(jī)理的研究[D];南京農(nóng)業(yè)大學(xué);2001年

4 付旭彬;肉雞急性熱應(yīng)激損傷及其機(jī)理的研究[D];南京農(nóng)業(yè)大學(xué);2002年

5 孫永建;熱應(yīng)激預(yù)適應(yīng)后HSP70的表達(dá)及其對(duì)大鼠肢體缺血再灌注損傷的影響[D];第一軍醫(yī)大學(xué);2002年

6 張根軍;生長豬熱應(yīng)激反應(yīng)模型及適宜監(jiān)測指標(biāo)篩選[D];中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2004年

7 蔣定文;胸腺基質(zhì)細(xì)胞對(duì)熱應(yīng)激小鼠胸腺細(xì)胞調(diào)節(jié)作用的研究[D];第一軍醫(yī)大學(xué);2000年

8 白兆鵬;硫辛酸對(duì)熱應(yīng)激下產(chǎn)蛋雞生產(chǎn)性能及抗氧化能力的研究[D];東北農(nóng)業(yè)大學(xué);2004年

9 李俊杰;熱應(yīng)激對(duì)種公牛精液品質(zhì)的影響及機(jī)理研究[D];河北農(nóng)業(yè)大學(xué);2001年

10 李東紅;熱應(yīng)激對(duì)肉雞實(shí)驗(yàn)性大腸桿菌病發(fā)病過程的影響[D];中國農(nóng)業(yè)大學(xué);2005年

本文編號(hào)：2695821