【摘要】： 目的 構(gòu)建反義CD40 RNA真核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染健康人及SLE患者的B細(xì)胞系，鑒定其抑制B細(xì)胞CD40表達(dá)的能力，并研究B細(xì)胞在CD40被抑制以后增殖能力、抗體分泌的改變，開辟一條利用反義CD40 RNA抑制B淋巴細(xì)胞異�；罨耐緩�，為研究B淋巴細(xì)胞功能異常所引起的自身免疫性疾病的發(fā)病機(jī)制及其治療提供理論依據(jù)。 方法 從健康人外周血單個核細(xì)胞提取總RNA，利用RT-PCR擴(kuò)增CD40部分序列，用T-A克隆技術(shù)形成PCR產(chǎn)物的克隆CD40／pUCm-T，并進(jìn)行基因測序。根據(jù)測序結(jié)果，應(yīng)用亞克隆技術(shù)反向接入真核表達(dá)載體pcDNA3，構(gòu)建成目的基因片段／載體重組體-CD40／pcDNA3。雙酶切法進(jìn)行鑒定，并利用T7引物鑒定重組體CD40／pcDNA3的方向。以脂質(zhì)體為介質(zhì)瞬時轉(zhuǎn)染健康人及SLE患者B細(xì)胞系，利用流式細(xì)胞技術(shù)檢測膜CD40的表達(dá)情況，并利用MTT比色法檢測細(xì)胞的增殖能力，，ELISA法檢測培養(yǎng)液的Ig濃度，以研究B細(xì)胞在CD40被抑制以后增殖能力、抗體分泌的改變。 結(jié)果 1、人反義CD40 RNA真核表達(dá)載體經(jīng)雙酶切檢驗(yàn)證明構(gòu)建成功，T7引物證明CD40片段為反向插入。2、與轉(zhuǎn)染pcDNA3空載體組或未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒組相比較，轉(zhuǎn)染CD40／pcDNA3的健康人及SLE患者B細(xì)胞系CD40的表達(dá)均明顯減少，增殖能力明顯下降，Ig的分泌受到明顯抑制。 結(jié)論 成功構(gòu)建了人反義CD40 RNA真核表達(dá)載體CD40／pcDNA3，此載體可有效的抑制健康人及SLE患者B細(xì)胞系CD40分子的表達(dá)，并抑制兩者的增殖及抗體分泌。CD40基因在B細(xì)胞的生長代謝、抗體分泌中起著重要作用，反義RNA技術(shù)可作為一種有效的免疫調(diào)控手段。
【學(xué)位授予單位】：福建醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2003
【分類號】：R392.1

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5 吳e

本文編號：2687622