本文關(guān)鍵詞：人源抗TLR4抗體Fab片段抑制內(nèi)毒素（LPS）引起的炎癥反應(yīng)的體內(nèi)及體外研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：Toll樣受體4(TLR4)是Toll受體家族中發(fā)現(xiàn)最早并研究最深的模式識別受體,在先天免疫中扮演重要的角色。TLR4主要識別內(nèi)毒素(LPS),激活其信號通路,引起急性炎癥、敗血癥、慢性感染性疾病等。TLR4是內(nèi)毒素發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)的瓶頸和內(nèi)毒素瀑布效應(yīng)的限速步驟,是整個內(nèi)毒素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的樞紐,阻斷TLR4對內(nèi)毒素信號的傳導(dǎo),是控制內(nèi)毒素生物效應(yīng)的最為有效的手段。因此,研究與開發(fā)治療性抗TLR4基因工程抗體,應(yīng)用于G-細(xì)菌感染性疾病和感染性休克的治療,有望能夠迅速阻斷病情發(fā)展、挽救患者的生命。在我們前期研究中,利用嵌合抗體技術(shù),針對人源抗TLR4抗體設(shè)計(jì)合成抗TLR4抗體Fab片段,利用重疊延伸法擴(kuò)增Fab片段基因,成功的構(gòu)建了質(zhì)粒,表達(dá)出抗TLR4抗體Fab片段,并命名為h TLR4-Fab04。在本研究中,我們主要通過建立細(xì)不同種系細(xì)胞及動物炎癥模型,在體內(nèi)外驗(yàn)證抗TLR4抗體Fab片段對LPS引起的炎癥反應(yīng)的抑制情況。研究方法1.分析h TLR4-Fab04是否結(jié)合小鼠巨噬細(xì)胞表面TLR4分子,探討h TLR4-Fab04阻斷LPS引起的TLR4信號通路活化后,Q-PCR和ELISA檢測相關(guān)炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-1和IFN-β在m RNA和蛋白水平的表達(dá)改變情況,觀察TLR4相關(guān)信號通路MAPKs、NF-κB和IRF-3等的磷酸化水平改變情況。2.分析h TLR4-Fab04是否結(jié)合小鼠樹突狀細(xì)胞表面TLR4分子,探討h TLR4-Fab04阻斷LPS引起的TLR4信號通路活化后,Q-PCR和ELISA檢測相關(guān)炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-1和IFN-β在m RNA和蛋白水平的表達(dá)改變情況,觀察TLR4相關(guān)信號通路MAPKs、NF-κB和IRF-3等的磷酸化水平改變情況。3.分析h TLR4-Fab04是否結(jié)合人外周血PBMC來源的巨噬細(xì)胞表面TLR4分子,探討h TLR4-Fab04阻斷LPS引起的TLR4信號通路活化后,Q-PCR和ELISA檢測相關(guān)炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-1和IFN-β在m RNA和蛋白水平的表達(dá)改變情況,觀察TLR4相關(guān)信號通路MAPKs、NF-κB和IRF-3等的磷酸化水平改變情況。4.分析h TLR4-Fab04是否結(jié)合人外周血PBMC來源的樹突狀細(xì)胞表面TLR4分子,探討h TLR4-Fab04阻斷LPS引起的TLR4信號通路活化后,Q-PCR和ELISA檢測相關(guān)炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-1和IFN-β在m RNA和蛋白水平的表達(dá)改變情況,觀察TLR4相關(guān)信號通路MAPKs、NF-κB和IRF-3等的磷酸化水平改變情況。5.利用小鼠內(nèi)毒素休克模型觀察h TLR4-Fab04在體內(nèi)炎癥反應(yīng)的抑制情況。將h TLR4-Fab04和對照抗體腹腔注射C57BL/6J小鼠,觀察h TLR4-Fab04對內(nèi)毒素休克小鼠血清細(xì)胞因子的變化情況。研究結(jié)果1.h TLR4-Fab04與人外周血來源的巨噬細(xì)胞及DCs表面TLR4分子結(jié)合率高達(dá)90%,與鼠源巨噬細(xì)胞及DCs表面TLR4分子結(jié)合率達(dá)到60%左右。2.在LPS誘導(dǎo)的四種細(xì)胞炎癥模型中,h TLR4-Fab04均可從m RNA水平和蛋白水平抑制炎癥因子(TNF-α、IL-6、IL-1和IFN-β)的表達(dá)。抑制效率都可以達(dá)到50%左右。3.在LPS誘導(dǎo)的四種細(xì)胞炎癥模型中,h TLR4-Fab04對TLR4信號通路下游的MAPKs(JNK、ERK、p38)、NF-κB(IKK、IκB、p65)和IRF-3磷酸化水平均有不同程度的抑制。4.在動物細(xì)胞模型中,不同濃度的hTLR4-Fab04均顯示出對小鼠血清中炎癥因子(TNF-α、IL-6、IL-1和IFN-β)有一定的抑制效果,當(dāng)h TLR4-Fab04濃度為2mg/kg時,對四種炎癥因子抑制效率最佳,抑制率均可達(dá)50%左右。結(jié)論本研究驗(yàn)證了h TLR4-Fab04可以與不同來源的細(xì)胞表面TLR4分子結(jié)合。在體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中,h TLR4-Fab04均顯示出對內(nèi)毒素(LPS)引起的炎癥反應(yīng)有抑制效果。本研究為h TLR4-FTLR4在臨床實(shí)驗(yàn)中提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。同時,也為治療SIRS等內(nèi)毒素感染引起的疾病提供了一種新的方法。
【關(guān)鍵詞】：Toll樣受體4 內(nèi)毒素 hTLR4-Fab04 炎癥反應(yīng) 炎癥因子 TLR4信號通路
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R392
【目錄】：

• 英文縮略詞匯表6-8
• 中文摘要8-11
• Abstract11-14
• 1. 前言14-18
• 2. 實(shí)驗(yàn)材料18-23
• 2.1 主要試劑與材料18-21
• 2.2 主要儀器21
• 2.3 常用溶液配制21-23
• 3. 實(shí)驗(yàn)方法23-30
• 3.1 細(xì)胞分離與培養(yǎng)23-25
• 3.2 體外實(shí)驗(yàn)25-28
• 3.3 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)28-30
• 4. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果30-46
• 4.1 h TLR4-Fab04 可與不同種系細(xì)胞表面TLR4 分子結(jié)合30-32
• 4.2 h TLR4-Fab04 抑制炎癥因子m RNA水平的表達(dá)32-36
• 4.3 h TLR4-Fab04 抑制炎癥因子蛋白水平的表達(dá)36-40
• 4.4 h TLR4-Fab04 抑制TLR4 信號通路磷酸化水平40-44
• 4.5 h TLR4-Fab04 抑制小鼠血清中炎癥因子釋放44-46
• 5. 討論46-49
• 6. 結(jié)論49-50
• 7. 參考文獻(xiàn)50-54
• 8. 附錄綜述54-64
• 參考文獻(xiàn)60-64
• 本人簡歷64-65
• 研究成果65-66
• 致謝66

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本文編號：268563