【摘要】： 約氏瘧原蟲(chóng)卵囊黑化是瘧原蟲(chóng)不能在大劣按蚊體內(nèi)發(fā)育成熟的主要表 型。目前推測(cè)，與岡比亞按蚊一樣，大劣按蚊黑化包被約氏瘧原蟲(chóng)可能也是 由PPO級(jí)聯(lián)反應(yīng)介導(dǎo)，但缺乏直接證據(jù)的支持。 PPO系統(tǒng)主要由識(shí)別/結(jié)合蛋白（recognition/binding protein）、PPO和 PPAE組成。其中，PO是PPO系統(tǒng)的關(guān)鍵成分之一，它是以酶原形式PPO 存在于昆蟲(chóng)體內(nèi)，具有MPO和DPO兩種酶活性。因此，本研究利用大劣 按蚊/約氏瘧原蟲(chóng)為模型，通過(guò)觀察感染約氏瘧原蟲(chóng)后大劣按蚊血淋巴PO 活性變化，以及卵囊黑化期間血淋巴蛋白的表達(dá)，探討PPO級(jí)聯(lián)反應(yīng)與約 氏瘧原蟲(chóng)卵囊黑化的關(guān)系以及卵囊黑化包被相關(guān)蛋白。 PPAE是一種分子量約為30KD的絲氨酸蛋白酶，而絲氨酸蛋白酶是絲 氨酸蛋白酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)的關(guān)鍵酶。大量研究發(fā)現(xiàn)，脊椎動(dòng)物和無(wú)脊椎動(dòng)物體內(nèi) 的絲氨酸蛋白酶對(duì)調(diào)節(jié)生理活動(dòng)和免疫反應(yīng)都具有重要作用。因此，本實(shí)驗(yàn) 克隆了AdsP，為進(jìn)一步研究其在按蚊黑化包被反應(yīng)中的調(diào)節(jié)作用打下基礎(chǔ)。 另外，還克隆了大劣按蚊S7，擬作為觀察感染瘧原蟲(chóng)后AdsP轉(zhuǎn)錄的內(nèi)參照。 選擇3-5日齡的雌大劣按蚊，分成不吸血組、吸正常血組和約氏瘧原蟲(chóng) 感染組。首先，經(jīng)非變性PAGE分離后，采用酶底物顯色方法，鑒定并測(cè) 定了血餐后d_5、d_7、d_(11)和d_(15)三組雌大劣按蚊血淋巴MPO和o-DPO酶活性。 結(jié)果顯示，感染組的血淋巴MPO和o-DPO酶活性明顯高于不吸血組和吸 正常血組（p＜0.05）；但是隨著約氏瘧原蟲(chóng)卵囊黑化比率的增高，感染組血 淋巴MPO和DPO活性逐漸下降，尤其以d_(15)最為明顯。 吸血感染后d_1、d_3、d_4和d_5分別收集三組雌大劣按蚊血淋巴，經(jīng)SDS- PAGE分離后，銀染顯色。以不吸血組和吸正常血組為對(duì)照，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，感 染組的雌大劣按蚊部分血淋巴蛋白表達(dá)增強(qiáng)，而部分蛋白表達(dá)卻減弱。 用煙草天蛾（Manduca Sexta）的PPO1 IgG檢測(cè)正常雌大劣按蚊血淋巴 PPO組成，發(fā)現(xiàn)大劣按蚊血淋巴 PPO有 87、67、63KD三條蛋白帶，而感 染組中相應(yīng)分子量的三條蛋白帶在山時(shí)開(kāi)始表達(dá)增強(qiáng)。 根據(jù)己報(bào)道昆蟲(chóng)的絲氨酸蛋白酶保守氨基酸序列設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物，以大 劣按蚊血細(xì)胞cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，目的片段進(jìn)行T／A克隆、測(cè) 序，首次獲得三種大劣按蚊血細(xì)胞絲氨酸蛋白酶 CDNA序列，AdSP、AdSPZ 和AdsP3。BLAST查詢結(jié)果顯示，AdsPI 與岡比亞按sP14DI、sP14DZ、 Holotrichia diomphalia PPAE－I和果蠅（Drosophil）Easter很相似；AdsPZ與 岡比亞按蚊 SPZA最相似；而 AdSP3與岡比亞按蚊 SP 4A有很高的同源性。 資料顯示，SP 4A、sP 4D和 sP 4D2可能是岡比亞按蚊的 PPAE，因此， 椎測(cè) AdsP和 AdsP3是大劣按蚊的 PPAE，可能調(diào)節(jié)黑化包被反應(yīng)。 同時(shí)，根據(jù)煙草天蛾、人、鼠和岡比亞按蚊的S7 mRNA序列，設(shè)計(jì)一 對(duì)簡(jiǎn)并引物，，克隆并測(cè)定大劣按蚊S7cDNA部分序列。Blast查詢發(fā)現(xiàn)，其 與人、鼠、岡比亞按蚊和煙草天蛾S7均有非常高的同源性。 上述結(jié)果提示，PPO級(jí)聯(lián)反應(yīng)可能介導(dǎo)了大劣按蚊黑化包被約氏瘧原 蟲(chóng)反應(yīng)，而且可能在山或更早期被激活；而卵囊黑化期間誘導(dǎo)的大劣按蚊 血淋巴蛋白在一定程度上與PPO級(jí)聯(lián)反應(yīng)主要成分相關(guān)。另外，BLAST結(jié) 果提示 AdsP和 AdsP3可能是大劣按蚊的 PPAE，可能調(diào)節(jié)大劣按蚊的黑 化包被約氏瘧原蟲(chóng)反應(yīng)。
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2001
【分類號(hào)】：R384.1

【引證文獻(xiàn)】

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1 王斌;γ-氨基丁酸對(duì)櫛孔扇貝免疫防御的影響[D];魯東大學(xué);2012年

本文編號(hào)：2680668