【摘要】：背景 活性氧(ROS)是體內(nèi)產(chǎn)生的一些反應(yīng)性較強(qiáng)的含氧物質(zhì)的總稱，正常情況下ROS的產(chǎn)生與清除處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，當(dāng)二者失衡時(shí)就會產(chǎn)生氧化應(yīng)激。過多的ROS不僅可以引發(fā)脂質(zhì)過氧化、糖化氧化，而且可以引起蛋白質(zhì)氧化。由氧化損傷導(dǎo)致的蛋白質(zhì)生化和結(jié)構(gòu)改變可引起功能改變，特別是代謝、酶活性或免疫活性的進(jìn)行性喪失。ROS介導(dǎo)的氧化損傷導(dǎo)致氨基酸殘基如酪氨酸的氧化，雙酪氨酸形成后引起蛋白質(zhì)凝聚、交聯(lián)和斷裂。AOPP(advanced oxidative protein products)就是近年發(fā)現(xiàn)的一種蛋白氧化產(chǎn)物。1996年Witko-Sarsat等首次在尿毒癥病人血漿中發(fā)現(xiàn)AOPP。其特征是在酸性條件下于340nm有特異吸收峰，含有大量羰基及雙酪氨酸，，主要存在于分子量600KD和80KD的蛋白質(zhì)中。蛋白電泳表明600KD產(chǎn)物為白蛋白聚合體，通過雙酪氨酸交聯(lián)而形成。已證實(shí)慢性腎衰(CRF)早期即有AOPP升高，隨腎衰進(jìn)展而進(jìn)一步升高，透析階段AOPP濃度更高，提示尿毒癥早期即存在明顯的氧化應(yīng)激(OS)狀態(tài)。 AOPP在體內(nèi)是由激活的中性粒細(xì)胞在髓過氧化物酶(MPO)作用下催化產(chǎn)生HOCl氧化白蛋白所致。體外用HOCl氧化白蛋白可得到與CRF病人血漿中類似的AOPP。對CRF病人的研究發(fā)現(xiàn)，血漿AOPP水平與單核細(xì)胞活化指標(biāo)新碟呤(neopterin)、腫瘤壞死因子a(TNF α)及其受體間呈正相關(guān)。體外研究發(fā)現(xiàn)AOPP可引起中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞的呼吸爆發(fā)，提示AOPP可能是一種致炎性尿毒素分子。已知AOPP含有大量活性羰基。羰基產(chǎn)物可引起一系列的生物學(xué)作用，如刺激細(xì)胞因子、黏附分子和生長因子的分泌等。AOPP是否也能引起單核細(xì)胞細(xì)胞因子的產(chǎn)生目前還沒有確切的證據(jù)。 我們以AOPP修飾的牛血清白蛋白作為AOPP模型，研究了AOPP對單核細(xì)胞分泌腫瘤壞死因子的影響及其可能機(jī)制。 方法 我們以單核細(xì)胞株THP一1和正常人外周血單核細(xì)胞(PBMC)為效應(yīng) 細(xì)胞，觀察AOPP一BSA對單核細(xì)胞分泌TNFa的影響，并對其機(jī)制進(jìn)行了 探討。 一、無內(nèi)毒素AOPP一BSA的體外制備:采用Witko--Sarsat等介紹的方 法。將BSA與次氯酸分別以1/70、1/140和1/280的摩爾比例混合，室溫 反應(yīng)30min，制備出三種不同修飾程度的AOPP一BSA。制備的AOPP一BSA在 PBS中透析，以除去游離的次氯酸。 AO即含量的測定:酸性條件下34Onm 的光吸收，以氯胺T為標(biāo)準(zhǔn)。 二、正常人外周血單核細(xì)胞(PBMC)的分離:采用密度梯度離心法。 將抗凝全血與6%葡聚糖按5:1混勻，37℃靜置6Omin，把血漿層輕鋪在 淋巴細(xì)胞分離液(相對密度1.077)上，室溫下以5009/min離心20min， 取中間云霧層細(xì)胞，用D一Hank液清洗后，于5%C姚孵箱中培養(yǎng)2小時(shí)后用 D一Hank液清洗以除去未貼壁細(xì)胞，將貼壁細(xì)胞消化收集，經(jīng)抗CD68抗體 染色鑒定，苔盼藍(lán)拒染試驗(yàn)證實(shí)為活細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度備用。 三、人單核細(xì)胞株THP一1的培養(yǎng):復(fù)蘇THP一細(xì)胞株，懸浮培養(yǎng)于含 10%(V/V)胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中。 四、TNFa的測定:ELISA法檢測培養(yǎng)上清和用不同抑制劑預(yù)處理后 培養(yǎng)上清的細(xì)胞因子TNFa。采用深圳晶美公司分裝的進(jìn)口雙抗體夾心 ELISATNFO檢測試劑盒。按說明操作。 五、細(xì)胞內(nèi)ROS的測定:采用熒光探針DCFDA標(biāo)記細(xì)胞，其在細(xì)胞 內(nèi)轉(zhuǎn)化為DCFH。用VICTOR1420多標(biāo)記分析系統(tǒng)在激發(fā)光485士10nm、發(fā) 射光535士10nm下動(dòng)態(tài)測定細(xì)胞經(jīng)不同刺激后細(xì)胞內(nèi)氧化DCFH產(chǎn)生的熒 光量的變化，反映細(xì)胞內(nèi)活性氧的產(chǎn)生量。 結(jié)果 1.A0即一BSA可誘導(dǎo)單核細(xì)胞分泌TNFa。三種氧化修飾程度的 AOPP一BSA均可顯著性刺激THP一1和PBMC產(chǎn)生TNFa，氧化修飾程度越 高則TNFa分泌的量越多，相同氧化修飾程度的AOPP一BSA以劑量依賴的 方式刺激TNFa分泌，6h時(shí)迅速上升至高水平，12h~24h進(jìn)一步達(dá)到平 臺水平。未經(jīng)修飾的BSA誘導(dǎo)產(chǎn)生TNFa的量不明顯。 2.AOPP一BSA可刺激單核細(xì)胞產(chǎn)生ROS。PBMC經(jīng)AOPP一BSA刺激后可 產(chǎn)生大量ROS，ROS的產(chǎn)生量與BSA的修飾程度及AOPP一BSA的濃度有關(guān)， 修飾程度越高，濃度越大，ROS產(chǎn)生量越高�？寡趸瘎㏄DTC和小分子谷 膚甘膚活氧化物酶模擬物Ebselen可不同程度地清除AOPP一BSA誘導(dǎo)產(chǎn) 生的ROS。NADPH氧化酶抑制劑DPI可顯著性抑制ROS的產(chǎn)生。 3.ROS介導(dǎo)了AOPP一BSA誘導(dǎo)產(chǎn)生TNFa (1)清除細(xì)胞內(nèi)ROS可抑制AOPP一BSA誘導(dǎo)的TNFa分泌�？寡趸瘎� PDTC 抑制AOPP誘導(dǎo)的ROS釋放后，THP一和PBMC分泌的TNFa均顯著減少。 (2)抑制NADPH氧化酶可抑制AOPP一BSA誘導(dǎo)的TNFa分泌。特異性 NADPH氧化酶抑制劑Apocynin以劑量依賴方式抑制TNFa分泌。 4.AOPP一BSA誘導(dǎo)產(chǎn)生TNFa與P38磷酸化有關(guān)。P38磷酸化抑制劑 SB203580可劑量依賴性抑制TNFa分泌。 結(jié)論 AOPP一BSA能誘導(dǎo)單核細(xì)胞分泌細(xì)胞因子TNFQ，其機(jī)制可能是通過 激活NADPH氧化酶釋放ROS，然后使P38磷酸化，進(jìn)一步導(dǎo)致了細(xì)胞因 子TNFa分泌。
【學(xué)位授予單位】：第一軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2004
【分類號】：R363

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本文編號：2675958