【摘要】： [目的]本實(shí)驗(yàn)試圖通過能中和VEGF生物活性的單抗從噬菌體隨機(jī)7肽、12肽文庫中篩選一種能抑制VEGF與血管內(nèi)皮細(xì)胞表面受體KDR(kinase domain receptor)結(jié)合的VEGF模擬短肽。對(duì)VEGF分子的受體結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行定位，探討小分子短肽作為血管細(xì)胞生長(zhǎng)抑制劑、腫瘤疫苗可行性。 [方法]以兩個(gè)具有中和VEGF活性的抗-VEGF單克隆抗體JH121、VG189為目標(biāo)，分別對(duì)噬菌體隨機(jī)7肽、12肽庫進(jìn)行篩選。并通過硝酸纖維膜斑點(diǎn)印跡法進(jìn)行陽性克隆鑒定。ELISA分析陽性噬菌體克隆與抗體的親和力。用高親和力克隆免疫小鼠檢測(cè)噬菌體表達(dá)短肽的免疫原性。檢驗(yàn)這種短肽可否模擬VEGF的抗原決定簇誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生能與VEGF結(jié)合的抗體，研究小鼠抗血清對(duì)HUVEC(人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞)生長(zhǎng)的抑制作用以及噬菌體表達(dá)的7肽和12肽對(duì)HUVEC生長(zhǎng)的抑制作用。 [結(jié)果]對(duì)肽庫進(jìn)行三輪篩選后，噬菌體克隆具有良好的富集效果。硝酸纖維膜斑點(diǎn)印跡法證實(shí)陽性率達(dá)到100％，通過ELISA檢測(cè)與抗體有高親和力的克隆。用篩選到的7肽、12肽陽性克隆免疫小鼠能激發(fā)產(chǎn)生強(qiáng)的免疫應(yīng)答，其抗血清與VEGF的交叉反應(yīng)比免疫VEGF的抗血清更強(qiáng)。測(cè)序結(jié)果顯示噬菌體上的短肽有共同序列：GWYYDAL、VASAVFYSALVE。短肽GWYYDAL引起的血清在不同濃度下呈劑量依賴性對(duì)VEGF誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)起抑制作用。說明該抗體具有阻斷VEGF-KDR的作用的功能。噬菌體表達(dá)的7肽GWYYDAL、12肽VASAVFYSALVE對(duì)HUVEC的生長(zhǎng)有明顯的抑制生長(zhǎng)作用，兩種短肽都呈劑量依賴性抑制VEGF誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)。兩者可能分別模擬了VEGF分子的21、25位氨基酸和14、17、21位氨基酸通過折疊后在三級(jí)結(jié)構(gòu)水平上形成的結(jié)合位點(diǎn)和VEGF競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合受體。 [結(jié)論]從噬菌體肽庫中篩選到了與抗體有高親和力的陽性噬菌體克隆，噬菌體表達(dá)的7、12肽GWYYDAL、VASAVFYSALVE模擬了VEGF的抗原表位，引起顯著的抗-VEGF抗體反應(yīng)。而且該模擬抗原表位可能與HUVEC上表達(dá)的VEGF受體結(jié)合，從而抑制了VEGF的促HUVEC生長(zhǎng)作用。這為進(jìn)一步定位VEGF抗原表位，研究VEGF受體結(jié)合抑制肽，設(shè)計(jì)腫瘤疫苗提供了有力的基礎(chǔ)。
【圖文】：

稍片哪弓燕浦湯石麗而花淤瓦漏正菇圖2VEGFR一l扭It一1、VEGrR-2/KDR信號(hào)傳導(dǎo)途徑與VEGF結(jié)合的胞外區(qū)7個(gè)免疫球蛋白樣超二結(jié)構(gòu)為代表。配體磷酸化胞質(zhì)區(qū)特異性酪氨酸殘基(圖中顯示出受體氨基酸序列中R一2中，，兒個(gè)胞內(nèi)信號(hào)蛋白通過受體與配體的結(jié)合直接被激活，如的幾個(gè)蛋白盡管起精確的活化機(jī)制尚未清楚，但也是經(jīng)VEGFR一2FAK、p38MApK、eNOS、Sre和pI3K(以?表示)。雖然Yll75具有結(jié)合PLC一r和sck的功能�？s寫:eNOS二內(nèi)皮一氧化氮合成酶;A絲裂原活化蛋白激酶;MEK=MAPK激酶;PI3K二磷酸醋酶3激酶脂酶C一r;PKC=蛋白激酶C;Sek=She樣蛋白;SHP一2=SHZ磷酸研究進(jìn)展與受體KDR的相互作用促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖及血管形成，有重要作用。阻斷VEGF的生物學(xué)活性是控制腫瘤生長(zhǎng)vEGF~KDR作用的方法是:l)抗vEGF抗體，包括單克

噬菌體展示膚庫是以線性噬菌體M13為載體，將基因片斷克隆在外殼蛋白gln或gvm的N端，使外源基因以gln或gVm融合蛋白的形式表達(dá)在噬菌體外殼上，使表型和基因型緊密地聯(lián)系起來(圖3)。由于編碼外源短膚的簡(jiǎn)并密碼子可指導(dǎo)合成全部20種氨基酸基1個(gè)終止子，從而使該膚庫包含了該長(zhǎng)度短膚的全部或絕大部分可能序列。由于線性噬菌體M13在噬菌體顆粒包裝時(shí)對(duì)DNA的長(zhǎng)度沒有限制，所以由M13衍生出來的載體系統(tǒng)也能表達(dá)較大的蛋白分子，如單鏈抗體可變區(qū)(scFv)，生長(zhǎng)激素(HGH)，胰蛋白酶(Trysin)等。噬菌體庫可以非常龐大，如隨機(jī)七膚庫復(fù)雜度可達(dá)到大于1護(hù)克隆，利用固定于固相支持物(通常為玻璃珠、酶標(biāo)板)的靶分子
【學(xué)位授予單位】：暨南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2002
【分類號(hào)】：R392

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本文編號(hào)：2670954