【摘要】： [背景]間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)是骨髓中的一類非造血干細(xì)胞，具有自我更新和多向分化的潛能。在適宜條件下，，可以向骨、軟骨、脂肪、心、肝、神經(jīng)等組織細(xì)胞轉(zhuǎn)化。其取材方便，體外擴(kuò)增容易，免疫排斥反應(yīng)小，已成為干細(xì)胞研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。而本課題組前期的研究工作發(fā)現(xiàn)全反式視黃酸(ATRA)在MSCs向神經(jīng)細(xì)胞分化中有重要作用，但是其作用機(jī)制目前尚不清楚，國(guó)內(nèi)外相關(guān)報(bào)道甚少。 [目的]探討ATRA和大腦微環(huán)境在MSCs向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化過(guò)程中的作用及機(jī)理。 [方法]從成年Wistar大鼠骨髓中分離得到MSCs，體外培養(yǎng)5～7代，接種于12孔培養(yǎng)板，達(dá)到70～80％融合后進(jìn)行誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)組加入0.5umol／L的ATRA作用24小時(shí)后，換用改良的神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)基(MNM)繼續(xù)培養(yǎng)；對(duì)照組不用ATRA預(yù)誘導(dǎo)，直接用MNM培養(yǎng)。采用免疫組化檢測(cè)誘導(dǎo)不同時(shí)刻MSCs表達(dá)nestin、NSE、NeuN、MAP-2、GFAP和RAR_β的情況，流式細(xì)胞儀檢測(cè)ATRA作用前后細(xì)胞增殖周期的變化。同時(shí)，將DAPI標(biāo)記的MSCs，注入大鼠大腦中動(dòng)脈梗塞(MACO)模型的腦 重慶醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文 內(nèi)，觀察MSCs在損傷腦組織中的存活、遷移和分化情況。 [結(jié)果」(1)MSCs在ATRA和MNM作用后，呈典型神經(jīng)元樣形態(tài)，伸出 較多的突起和分支，并形成網(wǎng)絡(luò)。(2)誘導(dǎo)后，實(shí)驗(yàn)組nestin、NSE、 NeuN和MAP一2的陽(yáng)性率明顯高于對(duì)照組，nestin最先表達(dá)，NSE、NeuN 其次，MAP一2表達(dá)最晚，在MNM作用9小時(shí)后方能檢測(cè)到。MNM作用18 小時(shí)后，Ne Stin表達(dá)最強(qiáng)，36小時(shí)后顯著減弱，而其他標(biāo)志物則持續(xù) 表達(dá)。(3)MSCs不表達(dá)RAR。，ATRA作用24小時(shí)后，RAR，表達(dá)增加， 陽(yáng)性率為20.3%士4.2%;MNM誘導(dǎo)6小時(shí)后，其陽(yáng)性率為70.2%士5.1%。 (4)ATRA作用前后，MSCS的細(xì)胞增殖周期無(wú)明顯變化。(5) MSCs植入 2周后，在MACO大鼠的腦組織見(jiàn)到了大量存活的MSCs，但僅有少許細(xì) 胞表達(dá)nestin、MAP一2和GFAP。 「結(jié)論〕(1)ATRA能夠促進(jìn) MSCS向神經(jīng)前體細(xì)胞和神經(jīng)元轉(zhuǎn)化，而 且其神經(jīng)蛋白分子的表達(dá)順序與神經(jīng)細(xì)胞發(fā)育過(guò)程一致。這為神經(jīng)細(xì) 胞的發(fā)育研究提供了一個(gè)較好的體外模型。(2) ATRA可能通過(guò)RAR，介 導(dǎo)基因的轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)MSCS向神經(jīng)細(xì)胞分化，這在國(guó)內(nèi)外還未見(jiàn)類似報(bào) 道。(3) MSCs的免疫原性小，在損傷腦組織中能夠存活、遷移并分化。
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ATRA對(duì)nestin、MAP一2、NSE、NeuN表達(dá)的影響在MNM誘導(dǎo)18小時(shí)后，我們檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組表達(dá)nestin、NSE、、NeuN及MAP一2的情況，結(jié)果如表1一6、圖1一7所示�？梢�(jiàn)采用ATRA預(yù)誘導(dǎo)后，nestin、以P一2、NSE及NeuN的陽(yáng)性率明顯高于對(duì)照組(P<0.05)。表1一6不同組別nestin、MAP一2、NSE及NeuN的表達(dá)對(duì)照組(MNM)實(shí)驗(yàn)組(ATRA+MNM)nestin50.6%士4.2%92.3%士3.4%NSE1%士2.5%NeuN48.7%士2.6%46.8%士3.7%6%士3.3%，1OJOJC乃

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