【摘要】：目的：白細(xì)胞介素10(interleukin 10，IL-10)是由單核-巨噬細(xì)胞分泌的一種蛋白質(zhì)，相對(duì)分子質(zhì)量約為21000Da。IL-10具有多種生物學(xué)活性，是一種多功能細(xì)胞抑制性因子，可抑制單核—巨噬細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞等炎癥細(xì)胞的激活及多種炎癥因子如IL-1β，腫瘤壞死因子α(TNF-α)，IL-6，IL-8，IL-12等的合成，在炎癥免疫反應(yīng)，腫瘤，病毒感染，造血系統(tǒng)，心血管系統(tǒng)等多方面發(fā)揮著重要的作用。本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建表達(dá)人重組白細(xì)胞介素10(recombinant human interleukin 10，rhIL-10)融合蛋白分子，通過(guò)Ni柱進(jìn)行親和層析，獲得一步純化的表達(dá)產(chǎn)物，為進(jìn)一步研究IL-10在臨床疾病應(yīng)用中的作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。 方法： 1、應(yīng)用RT-PCR方法擴(kuò)增IL-10基因，克隆PCR產(chǎn)物，構(gòu)建hIL-10重組質(zhì)粒，以AppiedBiosystems 3700 DNA分析儀進(jìn)行分析。采用構(gòu)建成功的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)pLyse細(xì)胞，12％SDS-PAGE和免疫印跡鑒定融合表達(dá)蛋白。 2、離心分離包涵體(IBs)，將IBs溶于7M尿素中，然后通過(guò)Ni柱進(jìn)行親和層析，以獲得一步純化的表達(dá)產(chǎn)物，純化產(chǎn)物稀釋復(fù)性。 3、以外周血單核細(xì)胞為研究對(duì)象觀察純化產(chǎn)物重組人IL-10對(duì)外周血單核細(xì)胞分泌TNF-α的抑制作用。 結(jié)果： 1、用RT-PCR方法擴(kuò)增IL-10基因，成功構(gòu)建IL-10質(zhì)粒，此質(zhì)粒在BL21(DE3)pLyse中得到高效表達(dá)。 2、rhIL-10經(jīng)Ni柱純化后純度為80.42％、回收率為66.72％。 3、對(duì)重組IL-10與TNF-α之間的關(guān)系的研究表明，隨著重組IL-10濃度的增加，單核細(xì)胞分泌TNF-α的含量逐漸減少，并且與對(duì)照組相比差異存在顯著性，表明IL-10可抑制TNF-α的分泌。 結(jié)論：成功構(gòu)建重組hIL-10質(zhì)粒載體，并在大腸桿菌BL21(DE3)pLyse細(xì)胞內(nèi)高效表達(dá)。純化樣品經(jīng)稀釋復(fù)性后，對(duì)單核細(xì)胞分泌致炎因子的功能有抑制作用。
【圖文】：

1%瓊脂精報(bào)膠電泳鑒定重組質(zhì)粒，結(jié)果見(jiàn)圖2。圖2質(zhì)粒ON^藺切圖諾1.609bpPcR產(chǎn)物2.重組IL-10cDNA雙酶切片段3.中X174H創(chuàng)姆mDNA標(biāo)準(zhǔn)4.入一H初LdlllDNA標(biāo)準(zhǔn)

含重組質(zhì)粒的BL21(DE3)pLyse細(xì)菌培養(yǎng)液經(jīng)IPTG(1mM)分別誘導(dǎo)培養(yǎng)不表達(dá)融合蛋白，12%SDS一PAGE電泳結(jié)果見(jiàn)圖3。凝膠圖象分析系統(tǒng)對(duì)電泳圖果為誘導(dǎo)0，1，2，3，，4h融合表達(dá)的rhIL一ro占總蛋白的含量分別為10.99%，.77%，35.73%，45.02%。
【學(xué)位授予單位】：武漢大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2004
【分類(lèi)號(hào)】：R392.1

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2 紀(jì)玉蓮,楊彥強(qiáng),陳永雄,姜宗培,張仕光,余學(xué)清,姜儻;表達(dá)白細(xì)胞介素10的系膜細(xì)胞基因轉(zhuǎn)移載體的建立[J];中華腎臟病雜志;1999年01期

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本文編號(hào)：2655922