【摘要】： 目的 1 人血小板因子4(h PF4)原核高效表達(dá)克隆的構(gòu)建 2 重組h PF4的表達(dá)及分離、純化工藝研究 3 重組h PF4的特性研究 方法 根據(jù)原核細(xì)胞表達(dá)真核蛋白的基因表達(dá)調(diào)控特點(diǎn)，設(shè)計(jì)合成一對(duì)特異引物，在PT7-7-r PF4表達(dá)質(zhì)粒的基礎(chǔ)上，應(yīng)用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)對(duì)其c DNA進(jìn)行改造，通過(guò)DNA重組技術(shù)構(gòu)建成重組h PF4原核表達(dá)質(zhì)粒PBV220-r hPF4，用快速PCR檢測(cè)法、DNA測(cè)序分析，鑒定重組h PF4表達(dá)質(zhì)粒的正確性。 PBV220-r hPF4用氯化鈣法轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α、BL21(DE3)，溫控誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白。SDS-PAGE、Western-blotting鑒定表達(dá)產(chǎn)物。采用超聲結(jié)合溶菌酶法破碎大腸桿菌，分析蛋白表達(dá)形式，可溶性重組蛋白部分用肝素—瓊脂親和層析、RP-HPLC純化重組h PF4，非可溶性部分經(jīng)包涵體分離、洗滌純化。研究重組h PF4的復(fù)性條件，采用空氣氧化法使重組h PF4正確重折疊。采用雞胚絨毛尿囊膜血管生成抑制實(shí)驗(yàn)觀察重組h PF4的血管生成抑制活性及復(fù)性效果。 結(jié)果 1 DNA測(cè)序證明PBV220-r hPF4表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建成功。PCR擴(kuò)增得到的h PF4基因片段去除了h PF4 c DNA 3末端AT富含的側(cè)翼區(qū)序列，原終止密碼子TAG定位突變?yōu)樵讼到y(tǒng)強(qiáng)的串聯(lián)終止密碼子TAATAA，3端設(shè)有SalⅠ位點(diǎn)，，5、末端設(shè)有EcoR Ⅰ、NcoⅠ位點(diǎn)，h PF4基因片段以EcoR Ⅰ/SalⅠ位點(diǎn)定向插入PBV220載體。 山西醫(yī)科大學(xué)2002屆碩士學(xué)位論文 一 2 DHS a／PBV220－r hPF4經(jīng)溫控誘導(dǎo)表達(dá)后，SDS－PAGE及凝膠密度掃描分 析，表達(dá)產(chǎn)物占總國(guó)體蛋白的25－30％，凝膠遷移特性與hPF4標(biāo)準(zhǔn)品相同。 Western－blotting檢測(cè)表達(dá)產(chǎn)物與兔抗人 h PF4抗體發(fā)生特異的抗原抗體反 應(yīng)。表明我們成功構(gòu)建了hPF4原核高效表達(dá)體系。 3 超盧結(jié)合溶由酶法破碎人腸桿菌后，經(jīng)分析 r hPF4主要以包涵體的形式存 ＿在，包涵體經(jīng)洗滌液I uOmMTrk－mPhs．趴10OmMN＊m：0．5mME0T兒 ZM瞧：0．2％TritonX－100 0．2％DOC）洗滌，再經(jīng)洗滌液 11（50mol幾，PH80 Trk．C卜mo＊M N＊m 山．5＊M EDTA：4M尿素：0．2％（Vv）Tr討。＊x－100 0．2％DOC）溶解包涵體沉淀。r hPF4純度可達(dá) 85％ 以上。r hPF4 E透析的 同時(shí)，采川立氣氧化法，加以 Cu‘至終濃度川”mol／1加速空氣氧化，使 r hPF4 上確顯折疊。 4 雞胚絨毛尿素膜血管生成抑制實(shí)驗(yàn)測(cè)定復(fù)性后的rhPF4的生物學(xué)活性，初 步結(jié)果顯示：rhPF4具有野生蛋白抑制血管生成的活性。 結(jié)論 本研究運(yùn)用 PCR定點(diǎn)突變技術(shù)，完全去除了 hPF4 cDNA基因 3”端 UTR AT 富含區(qū)：改用大腸桿菌強(qiáng)串聯(lián)終止密碼子T AAAATAA，成功構(gòu)建高效表達(dá)克隆 PBV220－rhPP4。我們構(gòu)建的r hPN原核高效表達(dá)系統(tǒng)經(jīng)m－PAGE及凝膠密度 掃描分析結(jié)果表明，r hPF4表達(dá)量占菌體總蛋白量的 25－30％，較原表達(dá)克隆 PT7－7／r h PF4提高了近80倍，經(jīng)快速高效的包涵體分高純化工藝和復(fù)性工 藝，rhPF4具有野生蛋白活性。本研究為rhPF4的結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系研究及規(guī)模 化生產(chǎn)奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)，也為真核蛋白在原核細(xì)胞中的表達(dá)調(diào)控機(jī)理提供 了理論依據(jù)。
【學(xué)位授予單位】：山西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2002
【分類號(hào)】：Q789

【參考文獻(xiàn)】

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