本文關(guān)鍵詞：microRNAs在人骨髓間充質(zhì)干細胞向汗腺樣細胞分化中的作用研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：【研究目的】1、利用胰蛋白酶-EDTA消化液分離純化原代培養(yǎng)的汗腺細胞,為下一步誘導(dǎo)實驗做準(zhǔn)備;2、篩選人骨髓間充質(zhì)干細胞和汗腺樣細胞之間差異表達的microRNAs,并利用生物信息學(xué)進行差異表達microRNAs的靶基因預(yù)測,尋找人骨髓間充質(zhì)干細胞向汗腺樣細胞分化的關(guān)鍵調(diào)控microRNAs,并初步預(yù)測其功能;3、探索microRNAs在人骨髓間充質(zhì)干細胞向汗腺樣細胞分化中的作用。【研究方法】1、采用II型膠原酶溶液消化皮膚并分離出汗腺細胞團;2、采用胰蛋白酶-EDTA消化液分離純化原代培養(yǎng)的汗腺細胞,并進行免疫組化鑒定培養(yǎng)的細胞,同時進行皮膚HE染色觀察正常人皮膚中的汗腺形態(tài)結(jié)構(gòu);3、對成骨細胞、成脂肪細胞誘導(dǎo)分化液誘導(dǎo)后的人骨髓間充質(zhì)干細胞分別進行茜素紅、油紅O染色,鑒定人骨髓間充質(zhì)干細胞的多向分化能力。采用Transwell培養(yǎng)板構(gòu)建人骨髓間充質(zhì)干細胞和熱休克汗腺細胞間接共培養(yǎng)誘導(dǎo)分化模型,并利用免疫熒光、RT-PCR和Western Blot技術(shù)對誘導(dǎo)后的人骨髓間充質(zhì)干細胞進行汗腺細胞表面標(biāo)志物的檢測;4、提取人骨髓間充質(zhì)干細胞和汗腺樣細胞的總RNA并作純化標(biāo)記,然后進行microRNAs芯片雜交并利用生物信息學(xué)進行靶基因預(yù)測,采用實時熒光定量PCR進行芯片結(jié)果的驗證,初步確定汗腺發(fā)育有關(guān)的microRNAs;5、將化學(xué)合成的特定的microRNAs mimics、microRNAs inhibitor、microRNA Negative Control分別轉(zhuǎn)染人骨髓間充質(zhì)干細胞并繼續(xù)與熱休克的汗腺細胞間接共培養(yǎng)誘導(dǎo)7天,之后采用免疫熒光、RT-PCR和Western Blot技術(shù)檢測特定microRNAs mimics、microRNAs inhibitor、microRNA Negative Control轉(zhuǎn)染后并間接共培養(yǎng)誘導(dǎo)的效果。【研究結(jié)果】1、經(jīng)胰酶-EDTA消化液分離純化后,去除了新生汗腺細胞周圍95%以上的成纖維細胞,得到了高純度的原代培養(yǎng)的汗腺細胞。2、人骨髓間充質(zhì)干細胞誘導(dǎo)后汗腺細胞表面標(biāo)志物cea、ck8、ck19表達陽性。3、經(jīng)過對micrornas芯片結(jié)果對比分析,人骨髓間充質(zhì)干細胞和其誘導(dǎo)分化來源的汗腺樣細胞之間micrornas表達水平絕對值相差2倍以上的micrornas有68個,其中上調(diào)的有19個,下調(diào)的有49個。表達水平上調(diào)相差5倍以上的micrornas有microrna-132-3p、microrna-4467、microrna-4484、microrna-146a-5p、microrna-6126等5個。表達水平下調(diào)相差5倍以上的micrornas有microrna-708-5p、microrna-138-5p、microrna-6812-5p、microrna-138-1-3p、microrna-1281、microrna-3157-3p、microrna-4298、microrna-4459等8個。4、實時熒光定量pcr檢測結(jié)果與micrornas芯片結(jié)果一致。5、生物信息學(xué)靶基因預(yù)測分析顯示:在這些差異表達的68個micrornas中,有18個micrornas靶向于已知的汗腺生長發(fā)育相關(guān)的nf-κb信號通路、mapk/erk信號通路、wnt/β-catenin信號通路和eda/edar信號通路中的多個基因。且microrna-138-1-3p改變明顯并與汗腺發(fā)育eda/edar信號通路中的eda基因有關(guān)。6、microrna-138-1-3pmimics轉(zhuǎn)染間接共培養(yǎng)組較micrornanegativecontrol轉(zhuǎn)染間接共培養(yǎng)組的eda基因表達減弱,形成的cea、ck19陽性細胞數(shù)量較少;microrna-138-1-3pinhibitor轉(zhuǎn)染間接共培養(yǎng)組較micrornanegativecontrol轉(zhuǎn)染間接共培養(yǎng)組的eda基因表達增強,形成的cea、ck19陽性細胞數(shù)量較多�！狙芯拷Y(jié)論】1、經(jīng)過胰酶-edta消化液差速消化法得到了高純度的原代培養(yǎng)的汗腺細胞;2、通過間接共培養(yǎng)誘導(dǎo)分化模型,能夠誘導(dǎo)人骨髓間充質(zhì)干細胞向汗腺樣細胞分化;3、人骨髓間充質(zhì)干細胞和其誘導(dǎo)分化來源的汗腺樣細胞之間有68個差異表達的micrornas,這些差異表達的micrornas可能在人骨髓間充質(zhì)干細胞向汗腺樣細胞分化過程中起作用;4、microrna-138-1-3p作用于eda/edar信號通路中的eda基因參與調(diào)控人骨髓間充質(zhì)干細胞向汗腺樣細胞分化。
【關(guān)鍵詞】：間充質(zhì)干細胞 汗腺 microRNAs 基因表達譜
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R329.2
【目錄】：

• 中文摘要4-7
• Abstract7-12
• 縮略語/符號說明12-14
• 前言14-17
• 研究現(xiàn)狀、成果14-16
• 研究目的、方法16-17
• 一、培養(yǎng)汗腺細胞的純化及hBM-MSCs誘導(dǎo)分化為汗腺樣細胞的研究17-39
• 1.1 對象和方法17-31
• 1.1.1 標(biāo)本來源17
• 1.1.2 主要儀器設(shè)備17-18
• 1.1.3 主要實驗試劑18-22
• 1.1.4 實驗方法22-31
• 1.2 結(jié)果31-36
• 1.2.1 骨髓間充質(zhì)干細胞向成骨、成脂細胞分化31-32
• 1.2.2 人汗腺的分離培養(yǎng)及形態(tài)學(xué)觀察32-33
• 1.2.3 培養(yǎng)人汗腺細胞的純化及免疫組化鑒定33-34
• 1.2.4 共培養(yǎng)體系誘導(dǎo)hBM-MSCs來源的汗腺樣細胞形態(tài)學(xué)觀察及表型鑒定34
• 1.2.5 汗腺發(fā)育表面標(biāo)志基因的水平改變34-35
• 1.2.6 汗腺發(fā)育表面標(biāo)志蛋白的水平改變35-36
• 1.3 討論36-38
• 1.3.1 汗腺的分離培養(yǎng)及純化36-37
• 1.3.2 hBM-MSCs誘導(dǎo)分化為汗腺樣細胞的模型構(gòu)建37-38
• 1.4 小結(jié)38-39
• 二、microRNA1381-3p在hBM-MSCs誘導(dǎo)分化為汗腺樣細胞中的作用研究39-57
• 2.1 對象和方法39-47
• 2.1.1 主要儀器設(shè)備39
• 2.1.2 主要實驗試劑39-41
• 2.1.3 實驗方法41-47
• 2.2 結(jié)果47-54
• 2.2.1 hBM-MSCs和其來源的汗腺樣細胞micro RNAs差異表達譜及靶基因預(yù)測47-49
• 2.2.2 microRNAs差異表達譜的驗證49
• 2.2.3 microRNA1381-3p轉(zhuǎn)染及轉(zhuǎn)染效率的檢測49-50
• 2.2.4 microRNA1381-3p轉(zhuǎn)染后細胞表型的變化50-51
• 2.2.5 microRNA1381-3p轉(zhuǎn)染后其靶基因及蛋白的變化51-54
• 2.3 討論54-56
• 2.3.1.hBM-MSCs和其來源的汗腺樣細胞microRNAs差異表達譜及靶基因預(yù)測分析54-55
• 2.3.2.microRNA1381-3p在hBM-MSCs向汗腺樣細胞誘導(dǎo)分化中的作用55-56
• 2.4 小結(jié)56-57
• 結(jié)論57-58
• 參考文獻58-62
• 發(fā)表論文和參加科研情況說明62-65
• 綜述65-75
• 綜述參考文獻71-75
• 致謝75

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