本文關(guān)鍵詞：膽汁酸分子與霍亂弧菌DsbA蛋白相互作用機(jī)制的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：霍亂弧菌為革蘭氏陰性菌,是人類傳染病霍亂的病原體,可引起感染者劇烈嘔吐,腹瀉,大量失水,甚至死亡�；魜y弧菌在宿主體內(nèi),只有進(jìn)入腸道并定殖于小腸上皮細(xì)胞后,其致病性相關(guān)毒素基因tcp和ct才會(huì)被大量表達(dá)。通過對(duì)小腸提取物分離純化分析發(fā)現(xiàn),腸道中的膽汁酸分子通過霍亂弧菌的DsbA蛋白使毒素基因調(diào)控蛋白TcpP形成更多具有功能的二聚體結(jié)構(gòu),從而誘導(dǎo)產(chǎn)生大量的毒素因子。敲除DsbA的編碼基因vcdsb A后,毒素基因的表達(dá)就不再受膽汁酸分子的誘導(dǎo),而且TcpP不能形成二聚體。因此,推測當(dāng)霍亂弧菌進(jìn)入人體腸道后,首先利用膽汁酸分子與DsbA的相互作用調(diào)控下游毒素基因網(wǎng)絡(luò),從而產(chǎn)生大量的毒素因子。為研究膽汁酸分子與DsbA的相互作用,首先將霍亂弧菌的DsbA蛋白編碼基因vc0034(vcdsb A)克隆至原核表達(dá)載體pET28a,轉(zhuǎn)化E.coli Rosetta進(jìn)行蛋白表達(dá),并使用鎳離子樹脂純化,得到霍亂弧菌DsbA蛋白。然后利用等溫滴定量熱(ITC)試驗(yàn)檢測膽汁酸分子TC與DsbA的互作情況。結(jié)果表明,TC與DsbA互作的平衡解離常數(shù)KD為0.93×10-4 M,化學(xué)計(jì)量比n為1.17 Sites,焓變化ΔH為-3647 cal/mol,熵變化ΔS為6.22 cal/mol,二者反應(yīng)熱量變化很大且親和力很強(qiáng),說明DsbA與TC確實(shí)存在相互作用。為了進(jìn)一步研究DsbA的生物學(xué)功能,進(jìn)行了胰島素還原酶試驗(yàn),發(fā)現(xiàn)DsbA還原酶活性受TC抑制。為了進(jìn)一步確定DsbA與膽汁酸分子互作的關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn),利用易錯(cuò)PCR的方法構(gòu)建了突變文庫,并通過檢測含有pBBRLux熒光報(bào)告質(zhì)粒的菌株的熒光表達(dá)冷光值的方法進(jìn)行文庫篩選,對(duì)突變的vcdsb A基因進(jìn)行序列測定。最終,從近一萬個(gè)突變株中篩選到dsbAH113L,dsb AD135V,dsb AE188A三個(gè)對(duì)TC不敏感的疑似株。為了進(jìn)一步研究這三個(gè)位點(diǎn)的作用,在大腸桿菌中表達(dá)了DsbAH113L,DsbAD135V,DsbAE188A三個(gè)蛋白。結(jié)果發(fā)現(xiàn)它們?cè)诖竽c桿菌dsbA缺失株中對(duì)TC較不敏感,但在霍亂弧菌dsb A缺失株中又變?yōu)檩^敏感,且TC影響突變體DsbA的還原酶活性,說明這些位點(diǎn)并不是DsbA與TC的互作位點(diǎn),其具體作用機(jī)制需進(jìn)一步探究。本論文進(jìn)一步揭示了膽汁酸分子與DsbA相互作用的分子機(jī)制,為今后篩選抑制DsbA功能的小分子抑制劑奠定了試驗(yàn)基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：霍亂弧菌 DsbA蛋白 膽汁酸分子 相互作用
【學(xué)位授予單位】：浙江農(nóng)林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R378
【目錄】：

• 摘要4-6
• ABSTRACT6-10
• 第一章 霍亂弧菌研究概況10-17
• 1.1 霍亂流行概況10-11
• 1.2 霍亂弧菌的生物學(xué)性狀11
• 1.3 霍亂弧菌毒力因子及其致病機(jī)理11-13
• 1.3.1 霍亂弧菌毒力島VPI與噬菌體CTXΦ12
• 1.3.2 毒素協(xié)同菌毛TCP12-13
• 1.3.3 霍亂毒素CT13
• 1.4 霍亂弧菌的毒素調(diào)控網(wǎng)絡(luò)13-15
• 1.4.1 ToxR調(diào)控元件14
• 1.4.2 ToxT調(diào)控14-15
• 1.5 二硫鍵氧化還原蛋白15-16
• 1.6 膽汁酸16
• 1.7 膽汁酸誘導(dǎo)TcpP二聚體形成16-17
• 第二章 霍亂弧菌DsbA蛋白表達(dá)純化17-30
• 2.1 試驗(yàn)材料與儀器17-20
• 2.1.1 菌株與質(zhì)粒17
• 2.1.2 試劑與溶液配制17-19
• 2.1.3 試驗(yàn)儀器19-20
• 2.2 試驗(yàn)方法20-27
• 2.2.1 蛋白原核表達(dá)重組質(zhì)粒的克隆20-25
• 2.2.2 DsbA蛋白的表達(dá)純化25-26
• 2.2.3 蛋白的透析26-27
• 2.3 試驗(yàn)結(jié)果與分析27-28
• 2.3.1 重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定27
• 2.3.2 重組蛋白的表達(dá)與純化27-28
• 2.4 討論28-30
• 第三章 等溫滴定量熱(ITC)試驗(yàn)與還原酶活性測定30-37
• 3.1 試驗(yàn)材料與儀器30-31
• 3.1.1 試劑與溶液30
• 3.1.2 試驗(yàn)儀器30-31
• 3.2 試驗(yàn)方法31-33
• 3.2.1 DsbA蛋白與膽汁酸互作分析ITC試驗(yàn)31-32
• 3.2.2 DsbA蛋白還原酶活性測定試驗(yàn)32-33
• 3.3 試驗(yàn)結(jié)果與分析33-35
• 3.3.1 ITC互作分析33-34
• 3.3.2 胰島素還原酶活性測定34-35
• 3.4 討論35-37
• 第四章 霍亂弧菌dsbA隨機(jī)突變基因文庫構(gòu)建及突變株篩選37-49
• 4.1 試驗(yàn)材料與儀器37-38
• 4.1.1 菌株與質(zhì)粒37
• 4.1.2 試劑與溶液37-38
• 4.2 試驗(yàn)方法38-44
• 4.2.1 隨機(jī)突變庫的構(gòu)建38-41
• 4.2.2 dsbA突變株篩選41-44
• 4.3 試驗(yàn)結(jié)果與分析44-47
• 4.3.1 隨機(jī)突變文庫的構(gòu)建44-46
• 4.3.2 疑似dsbA突變體定點(diǎn)突變46-47
• 4.4 討論47-49
• 第五章 霍亂弧菌dsbA突變體表型分析、蛋白表達(dá)純化及還原酶活性測定49-57
• 5.1 試驗(yàn)材料與儀器49
• 5.1.1 菌株與質(zhì)粒49
• 5.1.2 試劑與溶液49
• 5.1.3 試驗(yàn)儀器49
• 5.2 試驗(yàn)方法49-50
• 5.2.1 dsbA突變體在AML65(pMH501,Ptox T-lux)和V.C ΔdsbA Ptox T-lux中的熒光表達(dá)及運(yùn)動(dòng)性驗(yàn)證49-50
• 5.2.2 dsbA突變體蛋白表達(dá)純化50
• 5.2.3 dsbA突變體蛋白還原酶活性測定50
• 5.3 試驗(yàn)結(jié)果50-55
• 5.3.1 dsbA突變體在AML65(pMH501,Ptox T-lux)中的熒光表達(dá)及運(yùn)動(dòng)性驗(yàn)證50-52
• 5.3.2 dsbA突變體在V.C ΔdsbA Ptox T-lux中的熒光表達(dá)及運(yùn)動(dòng)性驗(yàn)證52-53
• 5.3.3 DsbA_(H113L)，DsbA_(D135V)，DsbA_(E188A)蛋白的表達(dá)純化53-54
• 5.3.4 DsbA_(H113L)，DsbA_(D135V)，，DsbA_(E188A)蛋白還原酶活性測定54-55
• 5.4 討論55-57
• 全文總結(jié)57-58
• 參考文獻(xiàn)58-65
• 縮略詞65-66
• 個(gè)人簡介66-67
• 致謝67

【參考文獻(xiàn)】

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1 Shyamapada Mandal;Manisha Deb Mandal;Nishith Kumar Pal;;Cholera:a great global concern[J];Asian Pacific Journal of Tropical Medicine;2011年07期

  本文關(guān)鍵詞：膽汁酸分子與霍亂弧菌DsbA蛋白相互作用機(jī)制的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：263143