【摘要】： 帕金森癥（Parkinson's disease，PD）的基本病理改變?yōu)橹心X黑質多 巴胺能神經(jīng)元進行性壞死，同時神經(jīng)元內(nèi)多巴胺合成代謝過程中的限速 酶——酪氨酸羥化酶（Tyrosine hydroxylase，TH）含量下降，其結果導致 紋狀體區(qū)多巴胺含量的顯著減少，引起各種臨床癥狀。目前PD的非手 術治療，以補充多巴胺合成的前體物質左旋多巴（L-3， 4-dihydroxyphenylalanine，L-dopa）為主，但隨著疾病的發(fā)展，存活的多 巴胺能神經(jīng)元及其酪氨酸羥化酶含量進一步下降，即使補充大量各類藥 物，也難以達到滿意療效。因此，有效地增加紋狀體區(qū)多巴胺能神經(jīng)元的 數(shù)量，增強神經(jīng)元合成多巴胺神經(jīng)遞質的能力，是治療PD的關鍵措施。 在腦紋狀體內(nèi)移植多巴胺能組織，以提高腦內(nèi)多巴胺神經(jīng)遞質的含量， 正發(fā)展成為一種新的治療方法。腦內(nèi)移植胚胎中腦組織治療PD的效果 得到廣泛確認，但是這種方法也存在一定的局限性，首先要同時獲得數(shù) 個胎齡相似的用于腦內(nèi)移植的胚胎非常困難，其次在倫理學上也存在激 烈的爭論，在很大程度上限制了這種方法的廣泛應用。為了增加紋狀體 多巴胺的含量，研究者們將成纖維細胞、成肌細胞等經(jīng)基因工程改造使 之表達酪氨酸羥化酶移植到紋狀體內(nèi)，增加多巴胺遞質的含量，以達到 治療PD的目的，但是這一類非神經(jīng)源性細胞不能在宿主腦內(nèi)長期存活， 不能與宿主腦神經(jīng)發(fā)生神經(jīng)整合，作用時間較短，效果仍不理想。因此， 尋找一種既能與宿主腦發(fā)生神經(jīng)整合，在宿主腦內(nèi)長期存活，又易于獲 得，易于在體外培養(yǎng)增殖，便與進行基因操作，表達酪氨酸羥化酶的的 細胞供體源，用于腦移植治療PD將有重要的意義。 自90年代初以來，學者們在對神經(jīng)發(fā)育的研究中發(fā)現(xiàn)一類廣泛存在 于哺乳動物CNS的未分化細胞。這類細胞具有自我分裂，，自我復制，自 我更新及自我維持的能力，并具有多種分化潛能，研究者認為這一類細 胞屬于神經(jīng)干細胞（NeUral Stem cells，NSCs）。神經(jīng)干細胞可在體外培養(yǎng)， 長期傳代，大量增殖，在體外誘導因子的作用下可以分化發(fā)育為成熟的 各種神經(jīng)細胞表型，尤其是分化成熟的神經(jīng)元具有完整的電生理功能， 腦內(nèi)移植后能長期存活，并與宿主腦細胞之間產(chǎn)生神經(jīng)整合，建立起復 雜而廣泛的突觸聯(lián)系。由于NSCs易于獲得，在體外增殖迅速，便于進 行基因工程操作，是基因治療CNS疾病的理想載體細胞。本研究中，我 們從胚胎 16天（Emb仰oic day 6，EI6）V讓tar大鼠前腦室管膜下周圍 區(qū)分離、鑒定、培養(yǎng)增殖了神經(jīng)干細胞c同時，我們將缺陷性逆轉錄病 毒載體NZA與多巴胺合成的限速酶基因TH一起構建了表達質粒，然后 將該表達質粒轉染PA3 I7細胞，收集經(jīng)PA3I，包裝產(chǎn)生的含TH－NZA具有 感染能力的逆轉錄病毒顆粒。并將收獲的h－NZA病毒感染體外培養(yǎng)的 神經(jīng)干細胞，誘導其分化后，用免疫熒光細胞化學的方法檢測到了TH 基因在分化細胞內(nèi)的表達。實驗結果如下： 1．構建并擴增Th－NZA表達質粒。 2．分離、鑒定、大量增殖和搜集了 EI6 Wstar大鼠前腦室管膜下周 圍區(qū)的NSCs。 3．建立了TH－N止轉染NSCS的有效方法，探索了逆轉錄病毒表達 質粒轉染NSCS的最佳條件。 4．以不同的條件在體外誘導NSCs分化為神經(jīng)元和神經(jīng)膠質細胞， 驗證了所分離的NSCS具有多分化潛能c 5．證實了轉染TH－N。A的NSCS分化為神經(jīng)元及膠質細胞后都能有 效地表達TH，并且，NSCS的神經(jīng)生物學特征不因TH－N。A的轉染而發(fā) 生變化。 總之，本實驗成功地進行了NSCs的分離、鑒定及體外培養(yǎng)，并完成 了重組逆轉錄病毒載體質粒N。A－TH對NSCS的轉染，證實了TH在分化 細胞中的表達，我們認為可在體外培養(yǎng)，大量擴增，并容易進行h基因 轉染，且能表達TH的NSCs可以作為腦內(nèi)細胞移植治療PD的供體源。
【學位授予單位】：第三軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2001
【分類號】：R329.2

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本文編號：2630890