【摘要】： 帕金森癥（Parkinson's disease，PD）的基本病理改變?yōu)橹心X黑質(zhì)多 巴胺能神經(jīng)元進(jìn)行性壞死，同時(shí)神經(jīng)元內(nèi)多巴胺合成代謝過程中的限速 酶——酪氨酸羥化酶（Tyrosine hydroxylase，TH）含量下降，其結(jié)果導(dǎo)致 紋狀體區(qū)多巴胺含量的顯著減少，引起各種臨床癥狀。目前PD的非手 術(shù)治療，以補(bǔ)充多巴胺合成的前體物質(zhì)左旋多巴（L-3， 4-dihydroxyphenylalanine，L-dopa）為主，但隨著疾病的發(fā)展，存活的多 巴胺能神經(jīng)元及其酪氨酸羥化酶含量進(jìn)一步下降，即使補(bǔ)充大量各類藥 物，也難以達(dá)到滿意療效。因此，有效地增加紋狀體區(qū)多巴胺能神經(jīng)元的 數(shù)量，增強(qiáng)神經(jīng)元合成多巴胺神經(jīng)遞質(zhì)的能力，是治療PD的關(guān)鍵措施。 在腦紋狀體內(nèi)移植多巴胺能組織，以提高腦內(nèi)多巴胺神經(jīng)遞質(zhì)的含量， 正發(fā)展成為一種新的治療方法。腦內(nèi)移植胚胎中腦組織治療PD的效果 得到廣泛確認(rèn)，但是這種方法也存在一定的局限性，首先要同時(shí)獲得數(shù) 個(gè)胎齡相似的用于腦內(nèi)移植的胚胎非常困難，其次在倫理學(xué)上也存在激 烈的爭論，在很大程度上限制了這種方法的廣泛應(yīng)用。為了增加紋狀體 多巴胺的含量，研究者們將成纖維細(xì)胞、成肌細(xì)胞等經(jīng)基因工程改造使 之表達(dá)酪氨酸羥化酶移植到紋狀體內(nèi)，增加多巴胺遞質(zhì)的含量，以達(dá)到 治療PD的目的，但是這一類非神經(jīng)源性細(xì)胞不能在宿主腦內(nèi)長期存活， 不能與宿主腦神經(jīng)發(fā)生神經(jīng)整合，作用時(shí)間較短，效果仍不理想。因此， 尋找一種既能與宿主腦發(fā)生神經(jīng)整合，在宿主腦內(nèi)長期存活，又易于獲 得，易于在體外培養(yǎng)增殖，便與進(jìn)行基因操作，表達(dá)酪氨酸羥化酶的的 細(xì)胞供體源，用于腦移植治療PD將有重要的意義。 自90年代初以來，學(xué)者們在對神經(jīng)發(fā)育的研究中發(fā)現(xiàn)一類廣泛存在 于哺乳動(dòng)物CNS的未分化細(xì)胞。這類細(xì)胞具有自我分裂，，自我復(fù)制，自 我更新及自我維持的能力，并具有多種分化潛能，研究者認(rèn)為這一類細(xì) 胞屬于神經(jīng)干細(xì)胞（NeUral Stem cells，NSCs）。神經(jīng)干細(xì)胞可在體外培養(yǎng)， 長期傳代，大量增殖，在體外誘導(dǎo)因子的作用下可以分化發(fā)育為成熟的 各種神經(jīng)細(xì)胞表型，尤其是分化成熟的神經(jīng)元具有完整的電生理功能， 腦內(nèi)移植后能長期存活，并與宿主腦細(xì)胞之間產(chǎn)生神經(jīng)整合，建立起復(fù) 雜而廣泛的突觸聯(lián)系。由于NSCs易于獲得，在體外增殖迅速，便于進(jìn) 行基因工程操作，是基因治療CNS疾病的理想載體細(xì)胞。本研究中，我 們從胚胎 16天（Emb仰oic day 6，EI6）V讓tar大鼠前腦室管膜下周圍 區(qū)分離、鑒定、培養(yǎng)增殖了神經(jīng)干細(xì)胞c同時(shí)，我們將缺陷性逆轉(zhuǎn)錄病 毒載體NZA與多巴胺合成的限速酶基因TH一起構(gòu)建了表達(dá)質(zhì)粒，然后 將該表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染PA3 I7細(xì)胞，收集經(jīng)PA3I，包裝產(chǎn)生的含TH－NZA具有 感染能力的逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒。并將收獲的h－NZA病毒感染體外培養(yǎng)的 神經(jīng)干細(xì)胞，誘導(dǎo)其分化后，用免疫熒光細(xì)胞化學(xué)的方法檢測到了TH 基因在分化細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下： 1．構(gòu)建并擴(kuò)增Th－NZA表達(dá)質(zhì)粒。 2．分離、鑒定、大量增殖和搜集了 EI6 Wstar大鼠前腦室管膜下周 圍區(qū)的NSCs。 3．建立了TH－N止轉(zhuǎn)染NSCS的有效方法，探索了逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá) 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染NSCS的最佳條件。 4．以不同的條件在體外誘導(dǎo)NSCs分化為神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞， 驗(yàn)證了所分離的NSCS具有多分化潛能c 5．證實(shí)了轉(zhuǎn)染TH－N。A的NSCS分化為神經(jīng)元及膠質(zhì)細(xì)胞后都能有 效地表達(dá)TH，并且，NSCS的神經(jīng)生物學(xué)特征不因TH－N。A的轉(zhuǎn)染而發(fā) 生變化。 總之，本實(shí)驗(yàn)成功地進(jìn)行了NSCs的分離、鑒定及體外培養(yǎng)，并完成 了重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體質(zhì)粒N。A－TH對NSCS的轉(zhuǎn)染，證實(shí)了TH在分化 細(xì)胞中的表達(dá)，我們認(rèn)為可在體外培養(yǎng)，大量擴(kuò)增，并容易進(jìn)行h基因 轉(zhuǎn)染，且能表達(dá)TH的NSCs可以作為腦內(nèi)細(xì)胞移植治療PD的供體源。
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2001
【分類號(hào)】：R329.2

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本文編號(hào)：2630890