【摘要】： 腫瘤生長依賴于血管生成，新生血管為腫瘤提供氧氣和營養(yǎng)，排出代謝廢物。沒有新生血管形成，腫瘤生長超不過幾個(gè)立方毫米，并且腫瘤生長速度與血管新生程度有關(guān)。新生血管在腫瘤轉(zhuǎn)移中也有重要作用，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞進(jìn)入血液循環(huán)，血管生長豐富的腫瘤比缺乏血管生長的腫瘤更容易發(fā)生轉(zhuǎn)移。因此抑制腫瘤組織的新生血管形成，從而抑制腫瘤生長和發(fā)生轉(zhuǎn)移已成為腫瘤治療的一個(gè)重要策略。 腫瘤細(xì)胞不僅可產(chǎn)生促進(jìn)血管生長因子，也能產(chǎn)生抑制血管生長因子，腫瘤生長受促進(jìn)或抑制血管生長因子的共同調(diào)控。1997年O'Rilly首次從小鼠內(nèi)皮細(xì)胞瘤培養(yǎng)液中分離出內(nèi)皮抑素(endostatin)，氨基酸序列分析顯示此蛋白是膠原ⅩⅧC末端的氨基酸片段，分子量為20KD。特異性蛋白水解酶降解膠原ⅩⅧ C末端的蛋白酶敏感區(qū)，產(chǎn)生內(nèi)皮抑素。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮抑素直接作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞，抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移，具有強(qiáng)烈抑制血管生成活性。研究內(nèi)皮抑素晶體結(jié)構(gòu)顯示其表面富含精氨酸殘基，是肝素結(jié)合位點(diǎn)，此位點(diǎn)與其抑制血管生長的功能活性有關(guān)。許多研究表明重組內(nèi)皮抑素特異性抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖，而且這種抑制作用呈劑量依賴性。細(xì)菌表達(dá)產(chǎn)物內(nèi)皮抑素大部分以不溶形式存在，將這種混懸液注射治療老鼠仍可以抑制腫瘤生長。于小鼠皮下重復(fù)注射內(nèi)皮抑素重組蛋白，幾乎完全抑制鼠Lewis肺癌等多種腫瘤生長，并無耐藥性產(chǎn)生，即使中斷治療腫瘤也不再復(fù)發(fā)。內(nèi)皮抑素是一種很有潛力的抗腫瘤血管生成藥物。 本文進(jìn)行小鼠內(nèi)皮抑素基因的克隆及表達(dá)，基因工程方法構(gòu)建了鼠內(nèi)皮抑素的溫敏型表達(dá)載體pBV220-endostatin，，為此作了以下工作： 1．從小鼠肝臟細(xì)胞中提取總RNA。設(shè)計(jì)合成一對特異引物，分別帶有EcoRI和BamHI的限制性內(nèi)切酶的識(shí)別位點(diǎn)。用RT-PCR法擴(kuò)增endostatin的基因片段，在endostatin基因的兩側(cè)引入EcoRI和BamHI酶切位點(diǎn)。 2．用EcoRI和BamHI酶切endostatin cDNA的PCR產(chǎn)物，將其插入到質(zhì)粒載體pBV220中相應(yīng)的限制性酶切位點(diǎn)，構(gòu)建非融合質(zhì)粒表達(dá)載體pBV220-endostatin。 3.將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到克隆菌DH5a中，經(jīng)PCR篩選和限制性內(nèi)切酶鑒定，得 到陽性克隆菌株。 4.以雙脫氧末端終止法對重組質(zhì)粒pBv220一endostatin進(jìn)行測序，結(jié)果表明與 己知小鼠endostatin基因序列一致。 5.溫度誘導(dǎo)重組質(zhì)粒pBv220一endostatin在宿主菌中表達(dá)外源蛋白。 6.用聚丙烯酞胺凝膠電泳檢測表達(dá)產(chǎn)物，在20KDa處有一特異蛋白條帶。 7.表達(dá)蛋白初步分離純化。 本文成功克隆鼠內(nèi)皮抑素基因，構(gòu)建了內(nèi)皮抑素基因的原核表達(dá)載體 pBV220一endostatin，該載體為非融合性表達(dá)載體，將pBV22o一endostatin成功轉(zhuǎn)化 到大腸桿菌表達(dá)菌DH5a中，并誘導(dǎo)表達(dá)了鼠內(nèi)皮抑素蛋白，為基因工程方法生 產(chǎn)內(nèi)皮抑素奠定一定基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：大連醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2003
【分類號(hào)】：Q786

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 張智清,姚立紅,侯云德;含P_RP_L啟動(dòng)子的原核高效表達(dá)載體的組建及其應(yīng)用[J];病毒學(xué)報(bào);1990年02期

本文編號(hào)：2628947