【摘要】： DAF（decay-accelerating factor，DAF）又名CD55；是一種GPI （glycosyl-phospatidylinositol）錨固型補體調(diào)節(jié)蛋白。它以糖基磷脂酰肌醇 鏈錨固于細胞膜外層，廣泛分布于造血干細胞、外周血細胞及其它多種組 織細胞表面，通過加速C3及C5轉(zhuǎn)化酶的衰變和阻止C3及C5轉(zhuǎn)化酶的 裝配，抑制補體兩條激活途徑的活化從而保護自身正常組織免受補體損傷。 DAF是一多功能分子，除補體抑制功能外，還可參與細菌、病毒微生 物的粘附作用和T細胞及單核細胞活化等免疫反應(yīng)過程。已有實驗證實抗 體交聯(lián)DAF可誘導單核細胞、粒細胞及外周血T淋巴細胞活化，抗體交 聯(lián)DAF與痕量PMA協(xié)同刺激能誘使T細胞發(fā)生增殖效應(yīng)。GPI錨固蛋白 參與信號轉(zhuǎn)導的機制已成為國內(nèi)外研究熱點之一，業(yè)已證實GPI錨固蛋白 缺失可影響T細胞的信號傳遞及細胞增殖效應(yīng)。而體外用抗體交聯(lián)細胞表 面的多種GPI錨蛋白均可使細胞活化。近來研究資料表明GPI錨固蛋白與 跨膜蛋白分子的隨機分布方式不同，GPI錨固蛋白在細胞膜上是以膜微區(qū) 形式分布，且已證實此膜微區(qū)中富含Src家族酪氨酸激酶及G蛋白等眾多 信號分子，說明膜微區(qū)是介導GPI蛋白信號傳遞的重要結(jié)構(gòu)。 為探討DAF對T細胞增殖效應(yīng)的影響及可能機制，本實驗以CD3~+與 CD3~-Jurkat細胞為實驗?zāi)Ｐ�，采用MTT比色實驗觀察抗體交聯(lián)針對DAF SCR3區(qū)的單抗DG3與固相化CD3mAb協(xié)同作用對CD3~+與CD3~-Jurkat 細胞增殖效應(yīng)，~3H-TdR摻入CTLL細胞增殖實驗檢測細胞培養(yǎng)上清IL-2 分泌水平，細胞 ELISA檢測 JUrkat細胞表面 IL－ZR a鏈的表達水平。結(jié)果 顯示交聯(lián)DG3與固相化CD3mAb對CD3”Jurkat細胞有較明顯的促增殖效 應(yīng)、并可促進其 IL－2的分泌與 IL－ZR a鏈的表達，而對 CD3haat細胞則 無此作用，該效應(yīng)可被Src家族酪氨酸激酶0TK）特異性抑制劑PPZ所 抑制。因此提示作為一種GPI錨聯(lián)蛋白，交聯(lián)CD55mAb可通過協(xié)同固相 化CD3mAb促進Jurkat細胞幾－2分泌與IL－ZR表達水平增加而促進細胞 的增殖效應(yīng)，該效應(yīng)是通過Src家族PTK所介導的。 為了進一步探討DAF的介導的信號傳導機制，我們應(yīng)用Western blot 增強化學發(fā)光技術(shù)分別觀察交聯(lián)CD55mAb與CD3mAbs分鐘后CD3”與 CD3刁urkat細胞的總蛋白酪氨酸磷酸化水平的變化，結(jié)果顯示二抗交聯(lián) DAF單抗 DG3或 CD3mAb均可使 CD3＋Jurkat細胞的細胞總蛋白酪氨酸磷 酸化水平增加，但細胞總蛋白磷酸化譜有所差異，提示DAF與CD3介導 的細胞信號傳遞通路有所不同。兔疫共沉淀實驗檢測到CD3“與CD3刁urkat 細胞 DAF均可與＊ 與 fyn的共沉淀，表明 DAF誘導細胞信號傳遞主要 是通過PTK所介導的。 為探討膜微區(qū)在DAF介導的Jurkat細胞信號傳遞中的作用，實驗中采 用溫和非離子去污劑 Tri。l－100，在低溫下用不連續(xù)蔗糖密度梯度離心的 方法成功抽提了CD3＋JUxkat 細胞膜去污劑抗性的膜成分 （detergent－Insoluble glycolipid emohed domain，DIG），，獲得了分離良好、 特異性高的＊ 樣品，在此 DIG中檢測到有 Src PTK以及 DAF的特異性 聚集，提示 DAF與 Src PTK的相互聯(lián)系是以膜微區(qū)為結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)的。免疫熒 光共聚焦掃描顯微技術(shù)分別檢測了CD3勺Urkat細胞在靜息狀態(tài)與交聯(lián)狀態(tài) 下分子對去污劑Triton－X100的抗性，結(jié)果顯示在細胞靜息狀態(tài)下CD3對 去污劑無抗溶性，表現(xiàn)為去污劑處理后，細胞免疫熒光顯色明顯減弱，熒 光分布彌散化，而DAF與＊ 有抗溶性，表現(xiàn)為去污劑處理后細胞兔疫熒 光存在有局限性聚集且聚集處熒光無明顯減弱。單抗交聯(lián)后，CD3對去污 劑抗性有所增加。甲基B環(huán)糊精（MpCD）處理細胞可特異地抽取胞膜表 面膽固醇從而破壞微區(qū)結(jié)構(gòu)，實驗中觀察到未交聯(lián)及交聯(lián)狀態(tài)CD3與DAF Vll ＞ 去污劑可溶性均增加，在靜息狀態(tài)下＊ 相對集聚于膜微區(qū)的能力也減弱。 綜合上述結(jié)果，可以得出以下結(jié)論：DAF不僅可作為補體調(diào)節(jié)因子調(diào) 節(jié)補體活化，還可以通過加強 CD3誘導的 IL2分泌與 IL上 a鏈的表達而 協(xié)同誘導T細胞活化與增殖；抗體交聯(lián)DAF可使Jurkat細胞的發(fā)生信號 傳遞事件，該效應(yīng)主要是通過其所連接的Src家族PTK所實現(xiàn)的；交聯(lián) DAF介導的細胞活化能完成T細胞活化早期事件，但最終完成T細胞增殖 和細胞因子分泌等晚期事件還需要有TCWCD3共同參與；靜息狀態(tài)下DAF 與Src家族PTK特異分布于膜微區(qū)中，因此生理條件下膜微區(qū)可輔助CD3 誘導傳遞T細胞活化信號。
【學位授予單位】：第三軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2001
【分類號】：R392.12

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 黃文棟，王亞凡;一種測定細胞增殖和衰減的快速比色分析法[J];生命的化學(中國生物化學會通訊);1994年06期

本文編號：2618492