【摘要】： DAF（decay-accelerating factor，DAF）又名CD55；是一種GPI （glycosyl-phospatidylinositol）錨固型補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白。它以糖基磷脂酰肌醇 鏈錨固于細(xì)胞膜外層，廣泛分布于造血干細(xì)胞、外周血細(xì)胞及其它多種組 織細(xì)胞表面，通過加速C3及C5轉(zhuǎn)化酶的衰變和阻止C3及C5轉(zhuǎn)化酶的 裝配，抑制補(bǔ)體兩條激活途徑的活化從而保護(hù)自身正常組織免受補(bǔ)體損傷。 DAF是一多功能分子，除補(bǔ)體抑制功能外，還可參與細(xì)菌、病毒微生 物的粘附作用和T細(xì)胞及單核細(xì)胞活化等免疫反應(yīng)過程。已有實(shí)驗(yàn)證實(shí)抗 體交聯(lián)DAF可誘導(dǎo)單核細(xì)胞、粒細(xì)胞及外周血T淋巴細(xì)胞活化，抗體交 聯(lián)DAF與痕量PMA協(xié)同刺激能誘使T細(xì)胞發(fā)生增殖效應(yīng)。GPI錨固蛋白 參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的機(jī)制已成為國內(nèi)外研究熱點(diǎn)之一，業(yè)已證實(shí)GPI錨固蛋白 缺失可影響T細(xì)胞的信號傳遞及細(xì)胞增殖效應(yīng)。而體外用抗體交聯(lián)細(xì)胞表 面的多種GPI錨蛋白均可使細(xì)胞活化。近來研究資料表明GPI錨固蛋白與 跨膜蛋白分子的隨機(jī)分布方式不同，GPI錨固蛋白在細(xì)胞膜上是以膜微區(qū) 形式分布，且已證實(shí)此膜微區(qū)中富含Src家族酪氨酸激酶及G蛋白等眾多 信號分子，說明膜微區(qū)是介導(dǎo)GPI蛋白信號傳遞的重要結(jié)構(gòu)。 為探討DAF對T細(xì)胞增殖效應(yīng)的影響及可能機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)以CD3~+與 CD3~-Jurkat細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停捎肕TT比色實(shí)驗(yàn)觀察抗體交聯(lián)針對DAF SCR3區(qū)的單抗DG3與固相化CD3mAb協(xié)同作用對CD3~+與CD3~-Jurkat 細(xì)胞增殖效應(yīng)，~3H-TdR摻入CTLL細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清IL-2 分泌水平，細(xì)胞 ELISA檢測 JUrkat細(xì)胞表面 IL－ZR a鏈的表達(dá)水平。結(jié)果 顯示交聯(lián)DG3與固相化CD3mAb對CD3”Jurkat細(xì)胞有較明顯的促增殖效 應(yīng)、并可促進(jìn)其 IL－2的分泌與 IL－ZR a鏈的表達(dá)，而對 CD3haat細(xì)胞則 無此作用，該效應(yīng)可被Src家族酪氨酸激酶0TK）特異性抑制劑PPZ所 抑制。因此提示作為一種GPI錨聯(lián)蛋白，交聯(lián)CD55mAb可通過協(xié)同固相 化CD3mAb促進(jìn)Jurkat細(xì)胞幾－2分泌與IL－ZR表達(dá)水平增加而促進(jìn)細(xì)胞 的增殖效應(yīng)，該效應(yīng)是通過Src家族PTK所介導(dǎo)的。 為了進(jìn)一步探討DAF的介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)機(jī)制，我們應(yīng)用Western blot 增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光技術(shù)分別觀察交聯(lián)CD55mAb與CD3mAbs分鐘后CD3”與 CD3刁urkat細(xì)胞的總蛋白酪氨酸磷酸化水平的變化，結(jié)果顯示二抗交聯(lián) DAF單抗 DG3或 CD3mAb均可使 CD3＋Jurkat細(xì)胞的細(xì)胞總蛋白酪氨酸磷 酸化水平增加，但細(xì)胞總蛋白磷酸化譜有所差異，提示DAF與CD3介導(dǎo) 的細(xì)胞信號傳遞通路有所不同。兔疫共沉淀實(shí)驗(yàn)檢測到CD3“與CD3刁urkat 細(xì)胞 DAF均可與＊ 與 fyn的共沉淀，表明 DAF誘導(dǎo)細(xì)胞信號傳遞主要 是通過PTK所介導(dǎo)的。 為探討膜微區(qū)在DAF介導(dǎo)的Jurkat細(xì)胞信號傳遞中的作用，實(shí)驗(yàn)中采 用溫和非離子去污劑 Tri。l－100，在低溫下用不連續(xù)蔗糖密度梯度離心的 方法成功抽提了CD3＋JUxkat 細(xì)胞膜去污劑抗性的膜成分 （detergent－Insoluble glycolipid emohed domain，DIG），，獲得了分離良好、 特異性高的＊ 樣品，在此 DIG中檢測到有 Src PTK以及 DAF的特異性 聚集，提示 DAF與 Src PTK的相互聯(lián)系是以膜微區(qū)為結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)的。免疫熒 光共聚焦掃描顯微技術(shù)分別檢測了CD3勺Urkat細(xì)胞在靜息狀態(tài)與交聯(lián)狀態(tài) 下分子對去污劑Triton－X100的抗性，結(jié)果顯示在細(xì)胞靜息狀態(tài)下CD3對 去污劑無抗溶性，表現(xiàn)為去污劑處理后，細(xì)胞免疫熒光顯色明顯減弱，熒 光分布彌散化，而DAF與＊ 有抗溶性，表現(xiàn)為去污劑處理后細(xì)胞兔疫熒 光存在有局限性聚集且聚集處熒光無明顯減弱。單抗交聯(lián)后，CD3對去污 劑抗性有所增加。甲基B環(huán)糊精（MpCD）處理細(xì)胞可特異地抽取胞膜表 面膽固醇從而破壞微區(qū)結(jié)構(gòu)，實(shí)驗(yàn)中觀察到未交聯(lián)及交聯(lián)狀態(tài)CD3與DAF Vll ＞ 去污劑可溶性均增加，在靜息狀態(tài)下＊ 相對集聚于膜微區(qū)的能力也減弱。 綜合上述結(jié)果，可以得出以下結(jié)論：DAF不僅可作為補(bǔ)體調(diào)節(jié)因子調(diào) 節(jié)補(bǔ)體活化，還可以通過加強(qiáng) CD3誘導(dǎo)的 IL2分泌與 IL上 a鏈的表達(dá)而 協(xié)同誘導(dǎo)T細(xì)胞活化與增殖；抗體交聯(lián)DAF可使Jurkat細(xì)胞的發(fā)生信號 傳遞事件，該效應(yīng)主要是通過其所連接的Src家族PTK所實(shí)現(xiàn)的；交聯(lián) DAF介導(dǎo)的細(xì)胞活化能完成T細(xì)胞活化早期事件，但最終完成T細(xì)胞增殖 和細(xì)胞因子分泌等晚期事件還需要有TCWCD3共同參與；靜息狀態(tài)下DAF 與Src家族PTK特異分布于膜微區(qū)中，因此生理?xiàng)l件下膜微區(qū)可輔助CD3 誘導(dǎo)傳遞T細(xì)胞活化信號。
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2001
【分類號】：R392.12

【參考文獻(xiàn)】

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1 黃文棟，王亞凡;一種測定細(xì)胞增殖和衰減的快速比色分析法[J];生命的化學(xué)(中國生物化學(xué)會通訊);1994年06期

本文編號：2618492