本文關(guān)鍵詞：基于生物傳感器的MERS冠狀病毒蛋白酶檢測(cè)模型及其應(yīng)用，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：背景:新發(fā)中東呼吸綜合征冠狀病毒(MERS-Co V)嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康,致死率遠(yuǎn)高于2003年的嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒(SARS-Co V),達(dá)40%以上。最近一次大爆發(fā)是去年5月份,在韓國(guó)引起了183人感染,死亡33人。冠狀病毒是一種廣泛存在,重組率高,種類(lèi)繁多,主要誘發(fā)人類(lèi)呼吸系統(tǒng)疾病的病毒,目前抗冠狀病毒藥物研究還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠�？刂撇《緩�(fù)制的復(fù)制酶復(fù)合體(RC)的形成依賴(lài)其主要蛋白酶(木瓜樣蛋白酶PLpro和3C樣蛋白酶3CLpro),而這兩種蛋白酶是冠狀病毒所特有,在人體內(nèi)并沒(méi)有與其相似或相同的蛋白,抑制病毒蛋白酶催化功能就可有效抑制病毒對(duì)底物的切割,從而阻斷病毒復(fù)制。本課題設(shè)想通過(guò)構(gòu)建一個(gè)基于熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)的生物傳感器,能夠在細(xì)胞水平對(duì)冠狀病毒蛋白酶作用機(jī)制進(jìn)行模擬,檢測(cè)蛋白酶對(duì)非結(jié)構(gòu)蛋白體的切割活性,進(jìn)一步利用該模型高靈敏度、高通量地篩選蛋白酶抑制劑。以此生物傳感系統(tǒng)及蛋白酶特異性切割的原理進(jìn)一步研究PLpro和3CLpro結(jié)構(gòu)并篩選蛋白酶抑制劑,為抗冠狀病毒藥物研究奠定基礎(chǔ)。目的:建立基于生物傳感器的冠狀病毒蛋白酶活性測(cè)定模型,利用該模型研究人類(lèi)MERS-Co V PLpro和3CLpro對(duì)催化底物及保守序列的識(shí)別特性,比較不同冠狀病毒蛋白酶活性的差異。并進(jìn)一步利用建立的模型進(jìn)行抗病毒蛋白酶抑制劑篩選,為抗人類(lèi)冠狀病毒藥物篩選提供研究基礎(chǔ)。方法:首先,合成MERS-Co V PLpro和MERS-Co V 3CLpro以及其各自底物p Glo-30F-M-nsp1/2,2/3,3/4(PLpro),4/5,5/6,6/7,7/8(3CLpro)的生物傳感器基因構(gòu)建體。其次,利用PCR定點(diǎn)突變?cè)噭┖袑Lpro/3CLpro蛋白酶催化活性中心Cys-His-Asp(PLpro)/His-Cys(3CLpro)分別突變?yōu)锳la,從而構(gòu)建蛋白酶活性缺失10突變體,同時(shí)構(gòu)建酶切底物pGlo-30F-M-nsp2/3,p Glo-30F-M-nsp7/8各識(shí)別位點(diǎn)的相應(yīng)突變體。再次,利用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)法測(cè)定MERS PLpro/3CLpro蛋白酶對(duì)底物的識(shí)別功能,比較不同冠狀病毒蛋白酶活性差異,并使用蛋白印跡法檢測(cè)蛋白酶在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)量。最后利用基于熒光素酶的冠狀病毒蛋白酶活性檢測(cè)的生物傳感器篩選冠狀病毒蛋白酶候選抑制劑。結(jié)果:1.成功構(gòu)建MERS PLpro蛋白酶生物傳感器,其主要部件包括MERS PLpro、基因工程構(gòu)建攜帶蛋白酶底物序列的傳感器質(zhì)粒,該模型作用原理是質(zhì)粒共轉(zhuǎn)HEK293T細(xì)胞表達(dá)后,蛋白酶識(shí)別切割底物,使得連接底物傳感器的熒光素酶發(fā)生構(gòu)象變化,兩個(gè)亞基結(jié)合到一起,從而激活熒光素酶底物釋放熒光,一旦不識(shí)別則構(gòu)象變化受到限制,難以激活熒光素酶,釋放的熒光量顯著較低。通過(guò)檢測(cè)熒光量間接表現(xiàn)蛋白酶的活性。該模型對(duì)不同底物切割的特異性,驗(yàn)證了該傳感器模型成功建立。2.應(yīng)用MERS PLpro蛋白酶的生物傳感器,研究驗(yàn)證MERS PLpro特異性識(shí)別切割非結(jié)構(gòu)蛋白位點(diǎn):在HEK 293T細(xì)胞中,MERS PLpro切割蛋白酶底物nsp2/3和nsp3/4更徹底,不完全切割底物nsp1/2。分別突變MERS PLpro各個(gè)蛋白酶催化活性位點(diǎn)后,發(fā)現(xiàn)蛋白酶對(duì)底物的識(shí)別切割效率顯著降低。此外,實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示當(dāng)傳感器底物p Glo-30F-M-nsp2/3的識(shí)別序列突變后,PLpro對(duì)位點(diǎn)LVGG的突變底物識(shí)別切割效率也明顯減弱。提示MERS-Co V PLpro特異性識(shí)別并切割底物,且識(shí)別位點(diǎn)高度保守序列,此切割作用依賴(lài)PLpro蛋白酶催化位點(diǎn)。3.不同冠狀病毒PLpro蛋白酶活性研究:使用MERS-Co V的傳感器底物,比較了SARS/MERS PLpro和PEDV/NL63 PLP2的識(shí)別切割效率。結(jié)果顯示,SARS和MERS兩種冠狀病毒的PLP蛋白酶存在很大相似性,而PEDV對(duì)其底物的切割效率較低,提示這種顯著的切割差異可能與病毒的種屬差異相關(guān)。4.成功構(gòu)建MERS 3CLpro蛋白酶生物傳感器,組成部分包括MERS 3CLpro、基因工程構(gòu)建的攜帶蛋白酶底物序列傳感器質(zhì)粒,通過(guò)對(duì)底物切割,驗(yàn)證了3CLpro蛋白酶生物傳感器模型成功建立。應(yīng)用MERS 3CLpro蛋白酶的生物傳感器,研究了MERS 3CLpro特異性地切割釋放底物蛋白:在HEK 293T細(xì)胞中,MERS 3CLpro切割蛋白酶底物nsp5/6和nsp7/8更徹底,不完全切割底物nsp6/7。分別突變MERS3CLpro的兩個(gè)催化活性位點(diǎn)后,發(fā)現(xiàn)對(duì)各個(gè)蛋白酶底物的識(shí)別切割效率顯著降低。此外,實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示當(dāng)傳感器底物p Glo-30F-M-nsp7/8的識(shí)別序列突變后,3CLpro對(duì)位點(diǎn)LQA的突變底物識(shí)別切割效率也明顯減弱。提示MERS-Co V 3CLpro特異性識(shí)別并切割底物蛋白的高度保守序列,且此切割作用依賴(lài)PLpro蛋白酶催化位點(diǎn)。5.不同冠狀病毒3CLpro蛋白酶活性研究:分別使用SARS和MERS兩種冠狀病毒的傳感器底物,比較了SARS和MERS 3CLpro的識(shí)別切割效率。結(jié)果顯示,SARS和MERS兩種冠狀病毒的3CL蛋白酶對(duì)不同底物的切割效率的趨勢(shì)一致,由此可見(jiàn)冠狀病毒蛋白酶功能的保守性,另外相比較而言SARS蛋白酶的切割活性較高,也可反映出切割效率與病毒傳播快慢的關(guān)系。6.基于以上研究基礎(chǔ),本課題應(yīng)用MERS PLpro和3CLpro兩個(gè)生物傳感器篩選了大量的化合物,包括小分子抗SARS藥物、天然提取藥物等,目前初步得到能夠抑制MERS 3CLpro活性的SARS 3CLpro蛋白酶抑制劑Cinaserin。結(jié)論:本研究成功構(gòu)建了基于生物傳感器的MERS-Co V蛋白酶活性測(cè)定模型。應(yīng)用該模型驗(yàn)證了MERS蛋白酶PLpro和3CLpro對(duì)底物的識(shí)別切割依賴(lài)其催化位點(diǎn),而且MERS-Co V蛋白酶的識(shí)別底物序列具有保守性。不同冠狀病毒蛋白酶對(duì)底物的切割具有差異性,推斷該差異性可能與宿主種屬以及病毒傳播特性有關(guān)。進(jìn)一步利用該模型初步篩選獲得了抗MERS冠狀病毒蛋白酶候選抑制劑Cinaserin。本研究為研究冠狀病毒蛋白酶結(jié)構(gòu)與功能以及新型抗病毒藥物篩選奠定了基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：MERS-CoV PLpro 3CLpro 生物傳感器 抑制劑
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：R373
【目錄】：

• 中英文縮略詞表7-9
• 摘要9-12
• Abstract12-16
• 1. 引言16-20
• 2. 實(shí)驗(yàn)材料20-25
• 2.1 細(xì)胞株20
• 2.2 質(zhì)粒20
• 2.3 主要試劑20-22
• 2.4 主要儀器和設(shè)備22-23
• 2.5 主要溶液及試劑配制23-25
• 2.5.1 常規(guī)試劑23-24
• 2.5.2 DNA分析試劑24
• 2.5.3 細(xì)胞培養(yǎng)相關(guān)試劑24
• 2.5.4 細(xì)菌培養(yǎng)相關(guān)試劑24-25
• 3. 實(shí)驗(yàn)方法25-38
• 3.1 MERS-CoV 3CLpro及其突變體的構(gòu)建25-27
• 3.1.1 設(shè)計(jì)引物25
• 3.1.2 定點(diǎn)突變PCR25-26
• 3.1.3 PCR產(chǎn)物回收后消化酶切26-27
• 3.1.4 轉(zhuǎn)化27
• 3.1.5 測(cè)序鑒定27
• 3.2 pGlo-30F-Substrates的構(gòu)建27-31
• 3.2.1 蛋白酶識(shí)別位點(diǎn)堿基序列合成27-28
• 3.2.2 寡核苷酸序列稀釋和退火28-29
• 3.2.3 pGlo-30F-RLKGG雙酶切29-30
• 3.2.4 載體脫磷酸化30
• 3.2.5 連接30
• 3.2.7 轉(zhuǎn)化30-31
• 3.2.8 測(cè)序鑒定31
• 3.3 pGlo-30F-Substrates識(shí)別位點(diǎn)突變體的構(gòu)建31-34
• 3.3.1 設(shè)計(jì)引物31-32
• 3.3.2 點(diǎn)突變PCR32-33
• 3.3.3 PCR產(chǎn)物回收后Dpn I消化酶切33-34
• 3.3.4 轉(zhuǎn)化34
• 3.3.5 測(cè)序鑒定34
• 3.4 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)MERS PLpro/3CLpro及其突變體活性34-36
• 3.4.1 鋪板34
• 3.4.2 轉(zhuǎn)染34-35
• 3.4.3 收集細(xì)胞35-36
• 3.5 Western blotting分析蛋白表達(dá)量36-38
• 3.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析38
• 4. 結(jié)果38-55
• 4.1 MERS-CoV基因組結(jié)構(gòu)和蛋白酶及其識(shí)別位點(diǎn)38-39
• 4.2 生物傳感器模型的原理及相關(guān)寡核苷酸的合成39-40
• 4.3 基于生物傳感器的MERS-CoV PLpro蛋白酶活性測(cè)定模型建立40-44
• 4.3.1 MERS-CoV PLpro蛋白酶活性檢測(cè)模型建立40-42
• 4.3.2 MERS PLpro蛋白酶催化位點(diǎn)鑒定42-43
• 4.3.3 MERS PLpro蛋白酶識(shí)別位點(diǎn)對(duì)生物傳感器的影響43-44
• 4.4 應(yīng)用PLpro生物傳感器比較不同冠狀病毒PLP蛋白酶活性44-47
• 4.4.1 比較MERS和SARS PLpro蛋白酶活性44-47
• 4.5 基于生物傳感器的MERS-CoV 3CLpro蛋白酶活性檢測(cè)模型47-51
• 4.5.1 MERS 3CLpro蛋白酶活性檢測(cè)模型的建立47-48
• 4.5.2 MERS 3CLpro蛋白酶催化位點(diǎn)鑒定48-50
• 4.5.3 MERS 3CLpro蛋白酶識(shí)別位點(diǎn)對(duì)生物傳感器活性的影響50-51
• 4.6 比較MERS和SARS 3CLpro蛋白酶活性的差異51-54
• 4.7 Cinaserin能夠抑制多種冠狀病毒 3CLpro蛋白酶活性54-55
• 5. 討論55-57
• 6. 結(jié)論57-59
• 參考文獻(xiàn)59-66
• 附錄 個(gè)人簡(jiǎn)歷66-68
• 致謝68-69
• 綜述69-85
• 參考文獻(xiàn)79-85

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本文編號(hào)：261835