【摘要】： 目的：克隆組織纖溶酶原激活物(t-PA)基因并構(gòu)建一種無細(xì)胞毒性、不激活原癌基因的真核表達(dá)的pcDNA3.1(+)/t-PA質(zhì)粒載體。 方法：采用高效Trizol試劑快速?gòu)奶悍谓M織中提取RNA，RT-PCR獲得t-PA cDNA，擴(kuò)增、純化、回收t-PA基因片段并將質(zhì)粒pcDNA3.1(+)和t-PA基因片段分別雙酶切，前者純化回收大片段，后者純化回收1.9kb片段，再將回收的pcDNA3.1(+)大片段與t-PA基因片段(1.9kb)重組。對(duì)重組pcDNA3.1(+)/t-PA質(zhì)粒進(jìn)行單酶切和雙酶切鑒定，并測(cè)序。 結(jié)果：成功地從胎兒肺組織中克隆了t-PA基因，并構(gòu)建了以pcDNA3.1(+)為載體的真核表達(dá)質(zhì)粒載體。重組的pcDNA3.1(+)/t-PA經(jīng)HindⅢ單酶切后出現(xiàn)了一個(gè)6.9kb片段、經(jīng)HindⅢ和BamHI雙酶切后出現(xiàn)了5.0kb和1.9kb兩個(gè)片段，測(cè)序結(jié)果證明為人全長(zhǎng)t-PAcDNA。 結(jié)論：含t-PA基因新型表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建的成功將為基因防治血管重建術(shù)中局部血栓形成奠定基礎(chǔ)。
【圖文】：

亞慶醫(yī)利·人學(xué)碩十學(xué)位論文作雙酶切(Hindlll和BamHI)電泳鑒定。單酶切(Hindlll)電泳鑒定。段序列的測(cè)定量抽提和純化重組質(zhì)粒，由上�；瞪锪Ｖ衪一PA基因片段進(jìn)行序列測(cè)定。的擴(kuò)增物，對(duì)胎兒肺組織中的t一隊(duì)進(jìn)行RT一PCR其中含酶切位點(diǎn)、強(qiáng)啟動(dòng)子、起始密碼子

隨機(jī)挑取菌落進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)，瓊脂糖電泳篩選陽性重組質(zhì)粒(約6.gkb)，以此重組質(zhì)粒為模板，用PCR法擴(kuò)增出約1.gkb的t一隊(duì)基因片段;同樣，用Hind111和BamHI雙酶切重組質(zhì)粒也可分離到1.gkb的基因片段。結(jié)果見圖1一3。5000bP20D0bP1000bP圖1一3pcDNA3.1加PA重組質(zhì)粒鑒定結(jié)果①重組質(zhì)粒peDNA3.1(+)/t一PA的Hindlll/BamHI雙酶切②空載體質(zhì)粒pcDNA3.1(+)的Hindlll/BamHI雙酶切③重組質(zhì)粒pcDNA3.l(+)/t一PA的Hindlll單酶切④重組質(zhì)粒peDNA3.1(+)/t一PA的PCR擴(kuò)增結(jié)果⑤DNA標(biāo)準(zhǔn)Figl一3TheresultsofidentificationofreeombinantPlasmidPcDNA3.1(+)/tPA①ReeombinantpeDNA3.l(+)/t一PAdigestedbyenzymeHindlllandBamHI②P1asmidpeDNA3.1(+)digestedbyenzymeHindlllandBamHI③ReeombinantpeDNA3.l(+)t一PAdigestedbyHindlll④ReeombinantpeDNA3.l/t一PAamplifiedbypCR.⑤Marker
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2002
【分類號(hào)】：Q782

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前8條

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本文編號(hào)：2614300