【摘要】： 目的 構(gòu)建一個(gè)完整的中國(guó)人β-地中海貧血（簡(jiǎn)稱β-地貧）突變基因標(biāo)準(zhǔn) 樣品庫(kù)。這個(gè)已知基因背景（DNA順序）的樣品庫(kù)可作為一種標(biāo)準(zhǔn)品用于 評(píng)價(jià)包括基因芯片在內(nèi)的檢測(cè)中國(guó)人β-地貧的診斷新技術(shù)的特異性和可 靠性。 方法 1、中國(guó)人β-地貧13種常見突變類型克隆基因庫(kù)的構(gòu)建：根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室 已保存的中國(guó)人β-地貧標(biāo)本，首先采用PCR技術(shù)直接從人基因組DNA 樣品中獲取目的基因—含某一突變的β-珠蛋白基因，然后運(yùn)用經(jīng)典的基 因工程技術(shù)將其克隆至pGEM-T載體，轉(zhuǎn)化的宿主菌為大腸桿菌 JM109。每個(gè)克隆重組子中插入的目的基因進(jìn)行DNA測(cè)序以驗(yàn)證基因 突變型。 2、16種中國(guó)人β-地貧稀少突變類型克隆基因庫(kù)的構(gòu)建：通過(guò)基于PCR 設(shè)計(jì)的人工致突變反應(yīng)體系從野生型樣品中制備含所需點(diǎn)突變的目的基 因，再運(yùn)用經(jīng)典的基因工程技術(shù)將誘變得到的目的基因進(jìn)行克隆并測(cè)序 鑒定。 3、兩種改進(jìn)的大引物PCR定點(diǎn)誘變方法的建立 方法1：構(gòu)建一個(gè)含全長(zhǎng)野生型β-珠蛋白基因的質(zhì)粒DNA模板，第 1輪PCR由中間的突變引物和正向外側(cè)引物合成大引物，在第2輪PCR 凝膠純化后的PCR產(chǎn)物—大引物全部加入反應(yīng)管同反向外側(cè)引物一起 合成全長(zhǎng)誘變終產(chǎn)物。 方法2：在兩輪PCR中設(shè)計(jì)兩種不同的質(zhì)粒DNA模板，兩者分別 缺少正向或反向外側(cè)引物可結(jié)合的互補(bǔ)序列，這樣兩種質(zhì)粒DNA模板 不可能同時(shí)被兩條外側(cè)引物擴(kuò)增而產(chǎn)生全長(zhǎng)野生型目的基因序列。第1 輪PCR由正向外側(cè)引物和突變引物在質(zhì)粒1的指導(dǎo)下合成大引物，這 一產(chǎn)物無(wú)需凝膠純化而直接取小量（2～3μl)用于第2輪PCR反應(yīng)。第2 輪PCR的第1階段在質(zhì)粒2的指導(dǎo)下由大引物延伸合成全長(zhǎng)突變終產(chǎn) 物，兩條外側(cè)引物則在第2階段指數(shù)擴(kuò)增，所有終產(chǎn)物均含所需致突變 位點(diǎn)。 結(jié)果 成功地定點(diǎn)誘變了中國(guó)人卜地貧16種稀少突變類型，誘變的成 功率可達(dá) 100％。完整地構(gòu)建了含 29種中國(guó)人p－地貧突變基因的克隆 庫(kù)。 結(jié)論 本研究建立了兩種改進(jìn)的、簡(jiǎn)便易行的大引物PCR定點(diǎn)誘變方 法，此方法可用作研究基因的表達(dá)以及蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能之間的關(guān)系 的基本技術(shù)。本研究的完成也為本實(shí)驗(yàn)室保存珍貴的DNA樣品提供了 一套常規(guī)的技術(shù)方法。研究所得到的中國(guó)人卜地貧突變基因克隆庫(kù)在診 斷用中國(guó)人卜地中海貧血基因芯片的研制中為建立反應(yīng)體系發(fā)揮了重要 作用，并可作為將來(lái)基因芯片新藥報(bào)批的標(biāo)準(zhǔn)品。
【學(xué)位授予單位】：第一軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2001
【分類號(hào)】：R556.61;Q78

【參考文獻(xiàn)】

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1 徐湘民;逆向點(diǎn)雜交技術(shù)及其在基因診斷中的應(yīng)用[J];國(guó)外醫(yī)學(xué).遺傳學(xué)分冊(cè);1994年06期

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本文編號(hào)：2611962