【摘要】：瘦素(leptin)是肥胖基因(obese gene，ob基因)的產(chǎn)物，具有抑制攝食、調(diào)節(jié)脂肪沉積與能量代謝的功能。1950年，Ingalls等首次發(fā)現(xiàn)并提出了ob基因的概念。1994年，Zhang等應(yīng)用定向克隆技術(shù)，克隆了人與小鼠的ob基因。Leptin的作用除與肥胖有關(guān)外，對(duì)多種生理過程都有調(diào)節(jié)作用，諸如生熱作用、免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)作用、青春期的始動(dòng)作用、生殖功能等。重組人leptin對(duì)于部分肥胖、糖尿病患者以及l(fā)eptin缺乏的個(gè)體或脂肪萎縮性糖尿病患者具有一定的療效。 本研究以克隆有小鼠肥胖基因的質(zhì)粒pMET mouse leptin為模板，PCR擴(kuò)增小鼠的ob基因，定向克隆至原核表達(dá)載體pET-28a(+)，，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET-28a-lep。經(jīng)酶切、PCR鑒定和DNA序列檢測(cè)正確后，轉(zhuǎn)化至E．coli BL21中，構(gòu)建工程菌株BL21-pET28-lep。37℃培養(yǎng)，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，小鼠瘦素融合蛋白以包涵體形式高效表達(dá)。加入十二烷基肌氨酸鈉(Sarkosyl)，采用直接處理菌體的方法進(jìn)行包涵體的變性與復(fù)性，達(dá)到了較好的效果。SDS-PAGE和Western blotting分析結(jié)果顯示，工程菌株BL21-pET28a-lep正確表達(dá)了帶有His Tag的小鼠瘦素融合蛋白，所表達(dá)的融合蛋白分子量為22.5 KD，大小與理論值相符；IPTG誘導(dǎo)6h，融合蛋白具有最高表達(dá)量。薄層色譜分析結(jié)果顯示，目的蛋白最高表達(dá)量為菌體總蛋白的39.2％。 應(yīng)用Ni~(2+)親和交換柱進(jìn)行了His融合蛋白的純化，純化后的融合蛋白含量為1.086 mg／ml。 綜上所述，運(yùn)用原和表達(dá)系統(tǒng)成功表達(dá)了小鼠ob基因，并應(yīng)用Ni~(2+)親和交換柱進(jìn)行了His融合蛋白的純化，這些為進(jìn)一步研究小鼠瘦素融合蛋白的結(jié)構(gòu)、生物活性以及與其它相關(guān)蛋白的關(guān)系等提供了基本的方法和手段。
【圖文】：

LR為單跨膜受體，由胞外、跨膜和胞內(nèi)三個(gè)結(jié)構(gòu)域構(gòu)成，對(duì)LR基因轉(zhuǎn)錄后形成的RNA加工方式不同，形成各種LR異形體。根據(jù)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域氨基酸序列及不同長短，將LR分成長受體和短受體兩種亞型。如圖1.2所示，已發(fā)現(xiàn)的LRa、LRb、LR。、LRd、LRe五種異形體的胞外結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域以及胞內(nèi)結(jié)圖1.2瘦素受體異形體結(jié)構(gòu)示意圖(引自Weigle，D.5.etal.seieneeandmedieine.1997，4，p40)Figl.2thesructUresofdifferentlePtinreeePtors(adaPtedfromw匕l(fā)gle，D.5.etai.Seieneeandmedieine.1997，4，P40)構(gòu)域的29個(gè)氨基酸序列完全相同

現(xiàn)進(jìn)行性向心性肥胖、高血糖和不育(圖和高血糖發(fā)生過程沒有明顯的影響，但加因突變小鼠(apoE一LDLR-l-zdb/db)遺傳基驗(yàn)室研究結(jié)果)。因此，該類多基因突變尿病等多因素誘導(dǎo)下的AS發(fā)生機(jī)理和各義的。素作為減肥治療藥物，正在進(jìn)行的研究包用表達(dá)產(chǎn)物治療人肥胖癥及其相關(guān)疾病低脂肪組織數(shù)量的效應(yīng)已經(jīng)在ob/ob小鼠/db小鼠沒有減肥效果。我國學(xué)者成功因小鼠[57]，在研究瘦素功能異常與其它用。
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2004
【分類號(hào)】：R346

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本文編號(hào)：2605410