【摘要】：目的:探索SARS冠狀病毒(SARS-CoV)S糖蛋白在真核細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)定位及其相關(guān)功能。方法:分別構(gòu)建融合有綠色熒光蛋白(GFP)基因或HA多肽抗原基因的SARS-CoV S糖蛋白全長cDNA質(zhì)粒,測序得到本實驗SARS-CoV樣本S糖蛋白的基因序列圖譜。利用生物信息學(xué)方法分析該樣本S糖蛋白的基因序列,尋找到新的突變位點,繪制進(jìn)化樹。通過預(yù)測S糖蛋白的普通物理化學(xué)性質(zhì),為下一步實驗提供相關(guān)信息和指導(dǎo)。利用非病毒性載體轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞,在激光共聚焦熒光掃描顯微鏡下,觀察融合了GFP的SARS-CoV S糖蛋白(SGFP)的亞細(xì)胞定位;同時利用SARS患者康復(fù)血清和HA抗體進(jìn)行蛋白印跡雜交,確定SARS-CoV S糖蛋白在真核細(xì)胞中的存在形式。結(jié)果:成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒GFPS-PCS,SGFP-PCS,HAS-pCDNA,SHA-PCS,分別將GFP基因或HA多肽抗原基因融合到SARS-CoV S糖蛋白基因的N端和C端。通過生物信息學(xué)分析預(yù)測,SARS-CoV S糖蛋白基因具有高度的突變能力,其分子量大小為139KD,等電點(PI)為5.54,在哺乳動物細(xì)胞內(nèi)表達(dá)穩(wěn)定,并具有兩個螺旋化螺旋結(jié)構(gòu)(coiled-coil)。在熒光顯微鏡下發(fā)現(xiàn),通過非病毒載體轉(zhuǎn)染的SGFP融合蛋白的熒光彌散于整個HeLa細(xì)胞內(nèi),尤以細(xì)胞核區(qū)和胞漿區(qū)較為密集,而沒有集中定位于細(xì)胞膜上。這種定位分布不隨蛋白表達(dá)時間延長而發(fā)生顯著變化。蛋白印跡雜交顯示在70～90KD的區(qū)域有特異性條帶。結(jié)論:利用非病毒性載體在HeLa細(xì)胞中表達(dá)的SGFP融合蛋白,主要分布于真核細(xì)胞核及胞漿內(nèi),少量定位于細(xì)胞膜上;SARS-CoV S糖蛋白在HeLa細(xì)胞中不是以完整形式存在,有被蛋白酶切割的可能性。
【圖文】：

在熒光顯微鏡下，I，11組中只有在I一C一l，I一C一2，I一T一2，11一C一1才能在細(xì)胞內(nèi)觀察到明顯綠色熒光，而I一T一1中沒有熒光顯示。選取實驗組I一C一1和l一T一2的熒光照片如下(圖3一)l:圖3一1:實驗組I中熒光顯微而鏡觀察結(jié)果A:實驗組I一C一1中的HLea細(xì)胞熒光顯微鏡照片/200;B:實驗組I一T一2中的HeLa細(xì)胞熒光顯微鏡照片x2002.2、激光共聚焦熒光掃描顯微鏡觀察結(jié)果在nl組中，利用共聚焦顯微鏡，分別觀察轉(zhuǎn)染質(zhì)粒SGFP一PCS16小時，24小時，48小時后的細(xì)胞熒光圖象，發(fā)現(xiàn)熒光分布在整個細(xì)胞之中，以細(xì)胞核和胞漿區(qū)較為集中。轉(zhuǎn)染16小時后，核區(qū)中熒光較為明顯，而在胞漿之中均勻分布(圖3一ZA、B);24小時后，核區(qū)及其周圍的胞漿中熒光繼續(xù)加強(qiáng)，細(xì)胞膜上有較強(qiáng)的熒光點出現(xiàn)(圖3一ZC、D);48小時后

在熒光顯微鏡下，I，11組中只有在I一C一l，I一C一2，I一T一2，11一C一1才能在細(xì)胞內(nèi)觀察到明顯綠色熒光，而I一T一1中沒有熒光顯示。選取實驗組I一C一1和l一T一2的熒光照片如下(圖3一)l:圖3一1:實驗組I中熒光顯微而鏡觀察結(jié)果A:實驗組I一C一1中的HLea細(xì)胞熒光顯微鏡照片/200;B:實驗組I一T一2中的HeLa細(xì)胞熒光顯微鏡照片x2002.2、激光共聚焦熒光掃描顯微鏡觀察結(jié)果在nl組中，利用共聚焦顯微鏡，分別觀察轉(zhuǎn)染質(zhì)粒SGFP一PCS16小時，24小時，48小時后的細(xì)胞熒光圖象，，發(fā)現(xiàn)熒光分布在整個細(xì)胞之中，以細(xì)胞核和胞漿區(qū)較為集中。轉(zhuǎn)染16小時后，核區(qū)中熒光較為明顯，而在胞漿之中均勻分布(圖3一ZA、B);24小時后，核區(qū)及其周圍的胞漿中熒光繼續(xù)加強(qiáng)，細(xì)胞膜上有較強(qiáng)的熒光點出現(xiàn)(圖3一ZC、D);48小時后
【學(xué)位授予單位】：四川大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2004
【分類號】：R373

【共引文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前7條

1 ;Diagnosis and Treatment of Porcine Transmissible Gastroenteritis[J];Animal Husbandry and Feed Science;2009年Z4期

2 陸柔劍;張陵林;譚文杰;周為民;王仲;彭X;阮力;;人冠狀病毒HCoV-NL63和HCoV-HKU1常規(guī)RT-PCR與實時熒光定量RT-PCR檢測方法的建立及應(yīng)用比較[J];病毒學(xué)報;2008年04期

3 許慧雯;王彥斌;吳超;王健偉;洪濤;;九種冠狀病毒核衣殼蛋白的原核表達(dá)及純化[J];基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床;2009年05期

4 陳會良;;豬傳染性胃腸炎的診治[J];畜牧與飼料科學(xué);2009年Z1期

5 陸柔劍;譚文杰;阮力;;新型人冠狀病毒HCoV-NL63和HCoV-HKU1的研究進(jìn)展[J];生物技術(shù)通訊;2008年01期

6 陳秋英;磨美蘭;莫藝基;梁海仙;葉新慧;黃文麗;闕久翔;韋平;韋天超;;變異型雞傳染性支氣管炎病毒對肉鴿的致病性試驗[J];畜牧與獸醫(yī);2010年11期

7 苗嵐飛;張振梅;祝超;姚貴哲;李金敏;崔尚金;;仔豬常見腸道疾病的鑒別診斷與防制[J];畜禽業(yè);2009年05期

相關(guān)博士學(xué)位論文 前8條

1 陳克研;豬血凝性腦脊髓炎免疫層析檢測試紙及其滅活疫苗的研制[D];吉林大學(xué);2011年

2 陸嘉琦;豬繁殖與呼吸綜合征病毒5'非翻譯區(qū)的結(jié)構(gòu)與功能解析[D];中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2011年

3 王玉燕;犬冠狀病毒的流行病學(xué)調(diào)查及地方株的特性研究[D];南京農(nóng)業(yè)大學(xué);2005年

4 鄭柯文;SARS冠狀病毒主蛋白酶和S蛋白的結(jié)構(gòu)與功能研究及其抑制劑的設(shè)計[D];浙江大學(xué);2005年

5 劉正學(xué);SARS病毒特異性抗原抗體基因和N基因的研究[D];武漢大學(xué);2005年

6 焦紅梅;減毒沙門氏菌介導(dǎo)的冠狀病毒基因疫苗及其免疫生物學(xué)特性[D];揚州大學(xué);2006年

7 孫東波;豬流行性腹瀉病毒S蛋白抗原表位鑒定及受體結(jié)合域的初步篩選[D];中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2008年

8 譚菲菲;豬繁殖與呼吸綜合征病毒核衣殼蛋白在病毒復(fù)制過程中的作用研究[D];中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2010年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 徐麗麗;豬流行性腹瀉病毒重組沙門氏菌的構(gòu)建及免疫原性分析[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2011年

2 肖文;豬傳染性胃腸炎病毒TaqMan熒光定量RT-PCR方法的建立及初步應(yīng)用[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2011年

3 黃欣;SARS-CoV N蛋白抗原表位的篩選及鑒定[D];中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院;2005年

4 鐘濤;間接競爭ELISA檢測TGEV方法的建立[D];東北農(nóng)業(yè)大學(xué);2006年

5 馬亞珍;2005-2006年雞傳染性支氣管炎病毒中國分離株分子流行病學(xué)研究[D];新疆農(nóng)業(yè)大學(xué);2007年

6 鄧小敏;雞傳染性支氣管炎病毒陜西分離株N基因的克隆與分子遺傳變異研究[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2007年

7 暢丹;豬傳染性胃腸炎病毒膠體金免疫層析試紙條的研制[D];東北農(nóng)業(yè)大學(xué);2008年

8 陸柔劍;四種常見及新發(fā)呼吸道病毒熒光PCR檢測方法的建立與初步應(yīng)用[D];中國疾病預(yù)防控制中心;2007年

9 楊德全;傳染性支氣管炎病毒核蛋白粘膜免疫及ELISA檢測方法的研究[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2008年

10 黃列;冠狀病毒HCoV-229E S1蛋白片段的原核表達(dá)及鑒定[D];佳木斯大學(xué);2008年

本文編號：2589878