發(fā)布時(shí)間：2020-03-15 03:58

【摘要】： 目的:臨床上腸球菌性心內(nèi)膜炎發(fā)病日益增多,為了更好地研究腸球菌心內(nèi)膜炎,本實(shí)驗(yàn)擬首先建立腸球菌心內(nèi)膜炎兔動(dòng)物模型,然后原核表達(dá)糞腸球菌心內(nèi)膜炎抗原(efaA)蛋白,為臨床腸球菌心內(nèi)膜炎致病機(jī)制、診斷防治及尋求非抗生素療法奠定基礎(chǔ)。 方法: 1.動(dòng)物模型建立:靜脈導(dǎo)管插入術(shù)建立腸球菌心內(nèi)膜炎動(dòng)物模型。模型建立后解剖取兔肺動(dòng)脈瓣贅生物,通過稱量贅生物濕重、計(jì)數(shù)贅生物分離培養(yǎng)落數(shù)、菌落PCR檢測(cè)、肺動(dòng)脈瓣病理組織學(xué)HE染色,綜合評(píng)價(jià)模型是否建立成功。 2. efaA蛋白的原核表達(dá)及純化:Genebank中獲得efaA基因全長(zhǎng)。PCR擴(kuò)增efaA基因片段,基因克隆技術(shù)構(gòu)建pET30a-efaA重組載體。采用氯化鈣共沉淀法將重組子轉(zhuǎn)化至E.coli DH5α和BL21(DE)。PCR、酶切、測(cè)序方法鑒定陽(yáng)性重組子。IPTG誘導(dǎo)BL21(DE)細(xì)菌重組腸球菌efaA蛋白表達(dá),SDS-PAGE、Western Blot方法分析鑒定。His.Bind純化試劑盒,分析重組蛋白的可溶性,親和層析純化重組蛋白,SDS-PAGE分析。 結(jié)果: 1.成功建立腸球菌心內(nèi)膜炎兔模型,兔心內(nèi)膜炎模型心臟可觀察到有贅生物生成。肺動(dòng)脈瓣贅生物重量是148 mg;贅生物勻漿后分離培養(yǎng)菌落計(jì)數(shù)為8.91 log10CFU/g;菌落PCR檢測(cè)觀察到與目的條帶大小一致的特異性條帶;肺動(dòng)脈瓣病理組織學(xué)HE染色觀察到有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn),并見大量由血小板、纖維素、壞死組織、炎癥細(xì)胞、大量細(xì)菌及肉芽組織所構(gòu)成的贅生物附著在動(dòng)脈瓣膜組織上。 2.成功構(gòu)建PET30a-efaA重組子,在pET30a系統(tǒng)中成功表達(dá)了efaA融合蛋白,獲得小量純化的重組蛋白。 結(jié)論: 1.成功建立腸球菌心內(nèi)膜炎兔模型,該模型存在細(xì)菌性心內(nèi)膜炎,有大量贅生物生成。 2.在pET30a系統(tǒng)中成功表達(dá)了efaA融合蛋白并小量純化,為進(jìn)一步大規(guī)模表達(dá)和純化efaA蛋白,研究其生物學(xué)活性及臨床診斷治療奠定基礎(chǔ)。
【圖文】：

麻醉后兔子取背側(cè)位，固定四肢，頸部皮膚用 75％乙醇消毒。順氣管右側(cè)切一 3～5 cm 切口，暴露頸外靜脈，絲線結(jié)扎，，在頸外靜脈結(jié)扎近心端 1～2 cm處止血夾夾住頸外靜脈，然后在兩處結(jié)扎之間眼科剪剪一斜切口，將導(dǎo)管插入血管內(nèi)然后移除止血夾，小心將引導(dǎo)管緩慢插入兔子右心室，量取切口處至兔子右心室距離約為 8 cm，移出引導(dǎo)管。根據(jù)引導(dǎo)管長(zhǎng)度截取相當(dāng)長(zhǎng)度的聚乙烯導(dǎo)管。聚乙烯導(dǎo)管頂部約 2cm 處做粗糙處理，然后將聚乙烯導(dǎo)管緩慢輕輕插入頸外靜脈，絲線外固定。然后導(dǎo)管順右頸外靜脈插入大約 8 cm，結(jié)扎固定好導(dǎo)管，剪去結(jié)扎線以外過長(zhǎng)的導(dǎo)管末端，止血鉗閉合導(dǎo)管游離端并觀察導(dǎo)管搏動(dòng)情況。最后絲線縫合好游離導(dǎo)管上端的皮膚切口。（圖 1－4 所示）

絲線外固定。然后導(dǎo)管順右頸外靜脈插入大約 8 cm，結(jié)扎固定好導(dǎo)管，剪去結(jié)扎線以外過長(zhǎng)的導(dǎo)管末端，止血鉗閉合導(dǎo)管游離端并觀察導(dǎo)管搏動(dòng)情況。最后絲線縫合好游離導(dǎo)管上端的皮膚切口。（圖 1－4 所示）圖 1：分離頸外靜脈并用絲線結(jié)扎圖 2：根據(jù)引導(dǎo)管插入長(zhǎng)度確定留置導(dǎo)管插入長(zhǎng)度
【學(xué)位授予單位】：福建醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號(hào)】：R-332

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2587109