發(fā)布時間：2020-03-02 05:40

【摘要】： 三磷酸腺苷(Adenosine triphosphate, ATP)是為細(xì)胞新成代謝提供能量的直接物質(zhì)。近二十年來,一些研究發(fā)現(xiàn),ATP還是一種重要的細(xì)胞外信號分子和營養(yǎng)因子,在中樞神經(jīng)和周圍神經(jīng)系統(tǒng)中有神經(jīng)遞質(zhì)的作用,而且能促進(jìn)神經(jīng)纖維的再生,延緩失神經(jīng)肌肉的萎縮,調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和分化,與多種細(xì)胞的凋亡也有密切的關(guān)系。肌源性干細(xì)胞(Muscle-derived Stem Cells, MDSC)是從骨骼肌組織中分離出的一類新型干細(xì)胞,表達(dá)造血干細(xì)胞的表型Sca-1和CD34,能向多種組織分化,自我更新能力強(qiáng),在細(xì)胞治療和基因工程研究中其表現(xiàn)明顯優(yōu)于肌衛(wèi)星細(xì)胞。本科室在前期工作中已經(jīng)證實了局部注射ATP能延緩失神經(jīng)肌肉萎縮,但其機(jī)理還未深入研究。本實驗就此方面進(jìn)行探討。 1.新生小鼠肌源性干細(xì)胞培養(yǎng)與鑒定:我們采用雙酶(膠原酶XI和胰蛋白酶)消化法消化分離小鼠骨骼肌組織,用差速貼壁法純化,成功地獲得原代肌源性干細(xì)胞,進(jìn)行免疫組化染色證實為Sca-1~+/CD34~+細(xì)胞,然后在高血清條件下進(jìn)行傳代增殖,了解其細(xì)胞生物學(xué)特性,在低血清條件下自主向成肌方向分化,形成肌管。從而證實小鼠骨骼肌組織中存在肌源性干細(xì)胞,它們能進(jìn)行原代和傳代培養(yǎng),并能夠增殖、分化、融合,形成新的肌纖維,修復(fù)骨骼肌的損傷。 2.ATP對體外培養(yǎng)的肌源性干細(xì)胞的作用及機(jī)理:通過第一部分中細(xì)胞分離純化方法獲得肌源性干細(xì)胞,傳代以便獲得數(shù)量足夠的細(xì)胞,然后在細(xì)胞培養(yǎng)基中加入ATP,通過MTT法,流式細(xì)胞學(xué)方法和RT-PCR檢測ATP對肌源性干細(xì)胞的作用。結(jié)果顯示ATP作用后第3天細(xì)胞增殖明顯加快;S期的細(xì)胞比例(S%)及增殖指數(shù)PrI值[(S+G2M)%]增高,G1%降低,細(xì)胞周期及G1和S亞周期的時間縮短。RT-PCR檢測到肌源性干細(xì)胞表達(dá)ATPR(P2Y1),且ATP能夠刺激P2Y1受體表達(dá)。因此,提出ATP在高血清條件下能促進(jìn)肌源性干細(xì)胞增殖,它可能是通過P2Y1受體起作用。 3.ATP對腫瘤壞死因子-α誘導(dǎo)肌源性干細(xì)胞凋亡保護(hù)作用的研究:利用TNF-α誘導(dǎo)肌源性干細(xì)胞凋亡,觀察ATP對細(xì)胞凋亡的影響。通過流式細(xì)胞學(xué)方法檢測細(xì)胞凋亡率,并檢測細(xì)胞凋亡蛋白酶Caspase-3和Caspase-8的表達(dá)。結(jié)果顯示,在TNF-α作用下,肌源性干細(xì)胞凋亡增加,ATP明顯降低TNF-α誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡率,減少Caspase-3~+和Caspase-8~+細(xì)胞百分率。因此,提出ATP抑制Caspase-3和Caspase-8的表達(dá),從而防止肌源性干細(xì)胞凋亡。 4.ATP對在體骨骼肌MDSC的作用研究:按常規(guī)方法造成小鼠坐骨神經(jīng)損傷模型,腓腸肌局部注射ATP,于術(shù)后不同時間點檢測肌源性干細(xì)胞增殖情況。結(jié)果顯示,在正常組和失神經(jīng)組,局部注射ATP后,肌源性干細(xì)胞數(shù)量增加,肌肉組織中Sca-1的表達(dá)增高,Sca-1~+細(xì)胞的百分比也升高,術(shù)后1周時達(dá)到最高,并一直持續(xù)到術(shù)后2周以后。因此,提出ATP能促進(jìn)失神經(jīng)肌肉肌源性干細(xì)胞增殖,從而延緩失神經(jīng)肌肉萎縮。 綜上所述,我們利用細(xì)胞分離培養(yǎng)技術(shù)和神經(jīng)損傷模型,采用免疫組織化學(xué)、流式細(xì)胞學(xué)、分子生物學(xué)等實驗方法和技術(shù)發(fā)現(xiàn)ATP延緩失神經(jīng)肌肉萎縮的機(jī)理之一是通過激活P2Y_1受體,加強(qiáng)核酸和蛋白質(zhì)的合成,縮短細(xì)胞周期,促進(jìn)肌源性干細(xì)胞增殖,而且還能減少骨骼肌失神經(jīng)后細(xì)胞的凋亡。
【圖文】：

aMDSC原代培養(yǎng)24h

bMDSC原代培養(yǎng)7d
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2006
【分類號】：R329.2

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2584262