【摘要】：干細胞因子(stem cell factor, SCF)是人體內重要的細胞因子,研究表明干細胞因子單獨或協(xié)同多種細胞因子,參與機體多種生理過程,包括調動造血干細胞、祖細胞的增殖和分化、調節(jié)肥大細胞的發(fā)生和發(fā)育、胚胎期及成年后神經系統(tǒng)的生長分化、黑素細胞的存活、分化、移行和增生等,是一種能刺激多種細胞生長發(fā)育的多功能細胞因子,具有廣闊的應用前景。目前在臨床上干細胞因子主要被用于外周血干細胞移植(PBSCT)后,調動外周血干/祖細胞的增殖和分化。但是天然SCF來源有限,難以大規(guī)模生產,不能滿足臨床需要。研究表明,基因重組人SCF(rhSCF)和天然SCF具有相同的生物學活性。本研究的目的是通過克隆可溶性干細胞因子活性部分基因片段,并使其在高效原核表達載體中大量表達,經純化得到得到高純度蛋白,為干細胞因子的臨床應用的進一步研究打下基礎。 用Trizol提取人骨髓細胞總RNA,通過RT-PCR擴增出人可溶性干細胞因子的活性部分,回收RT-PCR產物,并將其克隆到pMD1 8-T載體中轉化道大腸桿菌JM109中,藍白篩選并酶切鑒定陽性重組質粒后進行測序。將測序正確的克隆片斷定向連入原核表達載體pET32a(+),然后轉化到大腸桿菌JM109。篩選和鑒定正確地重組菌后,轉化到BL21中經IPTG誘導表達,使其表達出SCF融合蛋白。擴大培養(yǎng)后,超聲波破碎菌體,分離包涵體并溶于8M尿素,通過Ni~(2+)親和層析柱進行純化。 克隆得到的活性部分基因與GeneBank報道的序列完全相同。重組質粒pET-SCF構建正確,在表達宿主菌中表達出了大約37KD大小的融合蛋白。融合蛋白主要存在于包涵體中,收集包涵體并溶于8M尿素后,用Ni~(2+)親和層析柱對溶解液進行純化,得到的大部分融合蛋白,純度達到90%。
【圖文】：

對pMD18一T一NSZ重組質粒分別用primerM13一48測序，返回的測序報告表明:克隆得到的SCF基因郵04核昔酸組成，與最初的Gnbenak登錄的基因序列相比，序列完全相符。重組子可以用于下一步的實驗。見圖4。

Fig7DisruPtingcellsofPET32a一SCFl:ThesPuematnataetfrdisurPtingeellsofPET32a一SCF2:DPeositionatferdisurPtingofPET32a一SCF3，5，7:ThesPuematnatatferabstersionofinelusionbodies4，6，，8:DePositionatferbastersionofnielusionbodies和層析:S一PAGE電泳顯示在Bueff3r洗脫液中有符合分子量大7、8、9道為收集的緩沖液3(咪哇somM)、緩沖液3(哇15omM)、緩沖液3(咪哇200血M)、緩沖液3(咪啤2有雜蛋白出現(xiàn)，是因為非特異性結合而造成的，可能沖液1洗脫的量不夠和速度過快造成。9道為緩沖液3軟件分析蛋白含量約為90%。穿透收集液中幾乎不良好(圖8)
【學位授予單位】：四川大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2005
【分類號】：R346

【參考文獻】

相關期刊論文 前2條

1 馮小黎;重組包涵體蛋白質的折疊復性[J];生物化學與生物物理進展;2001年04期

2 寧云山,李妍,王小寧;包含體蛋白質的復性研究進展[J];生物技術通訊;2001年03期

本文編號：2577729