本文關(guān)鍵詞：miR-124對間充質(zhì)干細胞定向遷移的調(diào)控研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells, MSCs)是一種多能成體干細胞,其來源充足,容易擴增,免疫原性低,具有自我更新和多向分化潛能,很多研究表明MSCs可遷移至損傷或病變部位修復(fù)組織損傷,成為細胞治療理想的種子細胞。當組織受到損傷時,MSCs受到特定的細胞趨化因子(HGF、SDF、VEGF)或炎癥信號的作用定向遷移至受損或炎癥部位。但研究發(fā)現(xiàn)只有少量的MSCs可遷移至損傷區(qū)域,因此提高MSCs的定向遷移能力,增加遷移到損傷部位的移植細胞的數(shù)量至關(guān)重要,然而影響和控制這一趨化過程的分子機制還知之甚少。MicroRNAs (miRNAs)是一類長約20-24 nt的非編碼RNA,通過與信使RNA(mRNA)的3’非翻譯區(qū)(3'untranslated regions,3'UTRs)結(jié)合,使mRNA降解或者抑制靶基因的翻譯從而在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因的表達。隨著miRNAs的深入研究,越來越多的證據(jù)表明miRNAs對胚胎發(fā)育,細胞增殖,遷移和分化等具有重要的調(diào)控作用。然而關(guān)于miRNA參與調(diào)控MSCs的遷移還鮮有報道,本實驗旨在研究miR-124對MSCs定向遷移以及遷移相關(guān)通路Wnt/β-catenin信號的影響。本實驗室前期研究表明HGF能夠誘導(dǎo)MSCs的趨化性遷移,50 ng/ml HGF處理,細胞的遷移總數(shù)達到最大值。因此首先采用50 ng/ml的HGF刺激MSCs不同時間點(0h、0.5h、2h、5h、12h、24h), Q-PCR檢測miR-124的表達變化,結(jié)果顯示HGF處理MSCs 0.5 h,12h和24 h后,miR-124的表達顯著下調(diào),推測miR-124參與負向調(diào)控MSCs向HGF的趨化性遷移。接著在MSCs中轉(zhuǎn)染miR-124 mimic,使miR-124高表達,采用細胞劃痕實驗及Boyden chamber實驗檢測miR-124對MSCs遷移的影響,結(jié)果表明miR-124可顯著抑制MSCs的定向遷移。為了進一步驗證該結(jié)果,采用miR-124抑制劑下調(diào)MSCs中miR-124的表達,發(fā)現(xiàn)抑制miR-124促進劃痕的愈合,顯著促進MSCs向HGF的趨化性遷移。接著研究miR-124調(diào)控MSCs遷移的分子機制,通過Targetscan靶基因預(yù)測軟件分析,發(fā)現(xiàn)與細胞遷移相關(guān)的兩個基因FZD4和LRP6很可能是miR-124的靶基因。為了驗證FZD4和LRP6是否為miR-124的直接靶基因,我們克隆了含有兩個miR-124保守結(jié)合位點的FZD43'UTR片段以及LRP6的3'UTR全長序列,并使用PCR定點突變的方法將miR-124的靶位點突變失活,從而獲得野生型以及突變型的FZD4和LRP6雙熒光素酶報告基因載體。使用上述載體進行雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?結(jié)果表明miR-124確實能夠通過與FZD4和LRP6的3'UTR結(jié)合調(diào)節(jié)這兩個基因的表達。此外通過Q-PCR檢測發(fā)現(xiàn),高表達miR-124可顯著下調(diào)FZD4的mRNA水平,雖然LRP6在mRNA水平也下調(diào),但無顯著性差異。Western blot實驗證明在MSCs中高表達miR-124能夠下調(diào)FZD4及LRP6蛋白的表達。Wnt/p-catenin信號通路不僅影響腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移,對干細胞的維持,增殖和遷移同樣具有重要的作用。LRP6為Wnt/β-catenin信號通路的輔受體,可以通過胞外區(qū)結(jié)合Wnt蛋白和Frizzled (FZD)受體共同作用使β-catenin在胞質(zhì)內(nèi)累積進入細胞核,與轉(zhuǎn)錄因子TCF/LEF結(jié)合,調(diào)節(jié)下游靶基因的表達。本實驗研究發(fā)現(xiàn)miR-124直接靶向FZD4和LRP6,因此檢測miR-124對Wnt/β-catenin信號通路的影響。首先通過TOP/FOPFlash雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灆z測高表達miR-124對Wnt/p-catenin信號的影響,使用Wnt3a處理激活Wnt/β-catenin信號,結(jié)果發(fā)現(xiàn)高表達miR-124可顯著抑制細胞中的TOPFlash報告基因活性,FOPFlash報告基因沒有明顯變化。免疫熒光染色結(jié)果顯示高表達miR-124抑制β-catenin的入核,而抑制miR-124能夠促進β-catenin的入核。Western blot結(jié)果顯示在MSCs中高表達miR-124, p-β-catenin蛋白水平上調(diào),ABC (activated β-catenin)蛋白水平降低；當抑制miR-124時ABC的蛋白水平升高,而p-β-catenin蛋白水平降低。此外,研究發(fā)現(xiàn)高表達miR-124顯著抑制Wnt/β-catenin信號通路下游靶基因RUNX2和c-Myc的表達。以上這些結(jié)果說明miR-124能夠抑制Wnt/β-catenin信號通路。為了進一步研究miR-124調(diào)控MSCs的遷移是否與調(diào)控Wnt/β-catenin信號通路相關(guān),我們使用Wnt/β-catenin信號通路的激活劑Wnt3a和抑制劑FH535,采用Boyden chamber進行遷移實驗的研究。檢測結(jié)果顯示高表達miR-124顯著抑制了Wnt3a誘導(dǎo)的MSCs的遷移；而miR-124抑制劑對MSCs定向遷移的促進作用會被FH535阻斷。以上結(jié)果表明miR-124可能通過調(diào)控Wnt/β-catenin信號通路影響MSCs的定向遷移。細胞遷移是一個復(fù)雜精密的過程,包括細胞前端偽足的伸出,粘著斑(focal adhesions, FAs)的組裝和周轉(zhuǎn)以及細胞骨架的重排,因此我們最后檢測miR-124對粘著斑的數(shù)量,分布以及細胞骨架重排的影響。免疫熒光染色發(fā)現(xiàn),在MSCs中高表達miR-124,粘著斑的數(shù)量減少,周邊／中央粘著斑的比例降低。且高表達miR-124干擾細胞片狀偽足的形成,細胞骨架F-actin分布在細胞邊緣,胞體中央沒有明顯的細胞骨架結(jié)構(gòu)。綜上所述,miR-124通過調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin信號通路抑制MSCs的定向遷移。本實驗闡明了miR-124調(diào)控MSCs定向遷移的分子機制,為MSCs的臨床應(yīng)用提供了理論基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：miR-124 FZD4 LRP6 Wnt/β-catenin信號通路 MSCs遷移
【學位授予單位】：蘇州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R329.2
【目錄】：

• 中文摘要4-7
• Abstract7-12
• 序言12-15
• 材料與方法15-28
• 結(jié)果28-47
• 討論47-51
• 參考文獻51-57
• 結(jié)論57-58
• 綜述58-74
• 參考文獻66-74
• 碩士期間已發(fā)表及待發(fā)表的論文74-75
• 本研究所獲基金資助75-76
• 縮略表(ABBREVIATION)76-77
• 致謝77

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本文編號：257772