【摘要】： 固有性免疫應(yīng)答在機(jī)體抗病毒感染中起著重要的作用，表達(dá)在免疫細(xì)胞的模式識(shí)別受體(pattern recognition receptor，PRR)通過(guò)識(shí)別病原體的保守分子結(jié)構(gòu)即病原相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecular pattern，PAMP)，啟動(dòng)一系列信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑誘導(dǎo)保護(hù)性細(xì)胞因子如Ⅰ型干擾素(IFN-α和IFN-β)和前炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)，發(fā)揮直接抑制病毒復(fù)制的作用，并調(diào)節(jié)適應(yīng)性免疫應(yīng)答。Toll-樣受體(Toll-like receptor，TLR)是PRR的一種，與抗病毒作用有關(guān)的TLR包括TLR3、7、9，如TLR3能識(shí)別存在于病毒基因組或病毒復(fù)制時(shí)產(chǎn)生的dsRNA，TLR7和TLR8能識(shí)別富含GU序列的ssRNA病毒，TLR9則識(shí)別病毒基因的CpG-ODN。除TLR外，存在于細(xì)胞漿中的RNA解旋酶如視黃酸誘導(dǎo)基因Ⅰ(retinoic acid-inducible geneⅠ，RIG-Ⅰ)和黑素瘤分化相關(guān)基因5(melanoma differentiation-associated gene 5，MDA5)也能識(shí)別dsRNA，并誘導(dǎo)Ⅰ型干擾素(IFN-α和IFN-β)和前炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)。 HBV和HCV常引起持續(xù)感染并導(dǎo)致慢性肝炎、肝硬化甚至肝癌。IFN-α／β在抗慢性病毒感染中發(fā)揮重要作用，研究表明HBV和HCV可通過(guò)不同的機(jī)制抑制IFN-α／β的誘導(dǎo)或拮抗IFN-α／β的生物學(xué)活性，可能與HBV和HCV持續(xù)感染有關(guān)。HBV的核心蛋白抑制IFN-β的轉(zhuǎn)錄，HCV的NS3／4A蛋白阻斷仙臺(tái)病毒誘導(dǎo)的IRF-3的活化，從而阻斷IFN-β的表達(dá)。然而迄今HBV和HCV感染誘導(dǎo)肝臟局部產(chǎn)生IFN-α／β的機(jī)制尚不清楚。 目的： 本研究通過(guò)RT-PCR方法以及定量PCR方法檢測(cè)人正常肝細(xì)胞株L02細(xì)胞、肝癌細(xì)胞株SMMC7721和HepG2細(xì)胞與抗病毒固有性免疫應(yīng)答有關(guān)的受體表達(dá)以及不同PAMP刺激誘導(dǎo)細(xì)胞表達(dá)IFN-β的情況，以了解肝細(xì)胞對(duì)病毒PAMP的固有性免疫應(yīng)答特性，研究肝細(xì)胞內(nèi)的固有性抗病毒免疫途徑，為闡明HBV、HCV慢性感染發(fā)生機(jī)制提供理論基礎(chǔ)，同時(shí)為研究慢性病毒性肝炎的治療提供新的策略。 方法： 1．肝細(xì)胞表面固有性免疫識(shí)別受體及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白的檢測(cè)：設(shè)計(jì)和合成TLR3、TLR7、TLR8、TLR9、RIG-I、MDA5、MyD88及TRIF特異性引物，采用RT-PCR方法檢測(cè)L02、SMMC7721和HepG2細(xì)胞是否表達(dá)相應(yīng)的受體或蛋白。 2．肝細(xì)胞對(duì)不同病毒PAMP刺激的反應(yīng)性：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，ployI：C以0μg／ml、25μg／ml、50μg／ml直接或用以0μg／ml、2.5μg／ml、5μg／ml轉(zhuǎn)染，刺激細(xì)胞6h；polyU以0μg／ml、1μg／ml、2μg／ml轉(zhuǎn)染，刺激細(xì)胞24h；CpG-ODN以0μg／ml、10μg／ml、20μg／ml刺激細(xì)胞36h。每組2孔。刺激后提取細(xì)胞總RNA并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，熒光定量PCR檢測(cè)IFN-β的表達(dá)。 結(jié)果： 1．人肝細(xì)胞固有性免疫識(shí)別受體及其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白的表達(dá)：L02細(xì)胞表達(dá)TLR3、TLR7、TLR9、MDA5、MyD88和TRIF，SMMC7721表達(dá)TLR3、TLR7、TLR9、MDA5和MyD88，HepG2表達(dá)TLR3、TLR7、TLR8、TLR9、MDA5和MyD88。 2．PAMP刺激肝細(xì)胞后IFN-β的表達(dá)： (1)polyI：C刺激組：除高劑量(50μg／ml)刺激HepG2組外，經(jīng)polyI：C刺激后，L02、SMMC7721、HepG2細(xì)胞IFN-β的表達(dá)顯著增高(P＜0.05)，不同劑量組之間無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。 (2)polyI：C轉(zhuǎn)染組：polyI：C轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，與對(duì)照組相比，，L02細(xì)胞中IFN-β的表達(dá)水平顯著增高(P＜0.05)，不同刺激濃度之間無(wú)顯著差異(P＞0.05)；SMMC7721和HepG2細(xì)胞中IFN-β的表達(dá)無(wú)顯著差異(P＞0.05)。 (3)polyU轉(zhuǎn)染組：polyu轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，與對(duì)照組相比，L02細(xì)胞中KEN-β的表達(dá)水平無(wú)顯著增高(P＞0.05)，SMMC7721中IFN-β的表達(dá)顯著增高(P＜0.05)，且與刺激劑量有關(guān)(P＜0.05)，HepG2細(xì)胞中IFN-β的表達(dá)無(wú)顯著差異(P＞0.05)。 (4)CpG-ODN刺激組：CpG-ODN以高劑量(20μg／ml)刺激后，L02細(xì)胞中IFS-β的表達(dá)顯著增高(P＜0.05)，且與低劑量(10μg／ml)相比也顯著增高(P＜0.05)，SMMC7721和HepG2中IFN-β的表達(dá)無(wú)明顯差異(P＞0.05)。 結(jié)論： 人肝細(xì)胞表達(dá)固有性免疫識(shí)別受體如TLR3、TLR7、TLR9、MDA5以及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白如MyD88、TRIF。不同的PAMP如polyI：C、polyU以及CpG-ODN可通過(guò)相應(yīng)的受體誘導(dǎo)不同的肝細(xì)胞株表達(dá)IFN-β，提示正常肝細(xì)胞可能在抗病毒固有性免疫應(yīng)答中起著重要的作用，進(jìn)一步研究肝細(xì)胞抗HBV、HCV感染固有性免疫應(yīng)答特性以及HBV／HCV的調(diào)節(jié)作用，有利于闡明HBV、HCV慢性感染的發(fā)生機(jī)制，并為慢性病毒性肝炎提供新的治療策略。
【圖文】：

圖IL02細(xì)胞、SMMC7721細(xì)胞、HepGZ細(xì)胞表達(dá)TLR3、TLR7、TLRS、RIG一I、MDAS、MyD88及TRIFmRNA的Rl)PCR分析。Fig.IR不PCRanalysisoftheexPressionofTLR3/TLR7/TLRS/TLRg//MDAS/MyD88/TRIFmRNAinL02eell、SMMC772lcell、HePGZeell.

foyt:C直接刺激肝細(xì)胞誘導(dǎo)IF’N一p表達(dá)的RT一PcR分析。RT一PCRanalysisfortheexPressionofIFN一pinvarioushePattedbyPloyl:C.2，3:Polyl:CO林g/mlLane4，5，6:Polyl:C25林g/ml8，9:Polyl:C50林g/ml2l
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類(lèi)號(hào)】：R392

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