【摘要】： 精子發(fā)生和腫瘤之間存在許多相似性，其中一個(gè)重要的標(biāo)志就是數(shù)量不斷增加的腫瘤／睪丸(Cancer／testis，CT)基因的發(fā)現(xiàn)。發(fā)現(xiàn)并研究CT基因的功能，有利于對(duì)精子發(fā)生和腫瘤機(jī)制的闡明。 PRTD-NY2是本實(shí)驗(yàn)室在成人睪丸中克隆出的一條新基因，生物信息學(xué)提示它是一個(gè)F／RL家族的RGS蛋白，并且該基因的染色體定位區(qū)域與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。本研究中，我們對(duì)PRTD-NY2基因在精子發(fā)生和腫瘤發(fā)生過(guò)程中的作用及其機(jī)制進(jìn)行了探討。 首先我們通過(guò)RT-PCR發(fā)現(xiàn)PRTD-NY2為CT基因。人睪丸組織免疫組化，顯示PRTD-NY2蛋白細(xì)胞定位在生精上皮的精原細(xì)胞和精母細(xì)胞細(xì)胞漿以及精子細(xì)胞的細(xì)胞漿和細(xì)胞核中表達(dá)；精子免疫熒光提示PRTD-NY2定位于核后區(qū)的胞漿和胞質(zhì)殘余體中；RT-PCR顯示PRTD-NY2在成人睪丸高表達(dá)；在唯支持細(xì)胞綜合癥患者中不表達(dá)；在生精阻滯于精子細(xì)胞前的病人中幾無(wú)表達(dá)，從而提示PRTD-NY2可能主要在精子細(xì)胞及以后的精子發(fā)生中發(fā)揮作用。 RGS蛋白可以直接與激活的Gα亞基結(jié)合來(lái)負(fù)調(diào)節(jié)G蛋白信號(hào)，即失活Gα亞基并降低G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)信號(hào)，為負(fù)調(diào)控因子。因此進(jìn)一步我們通過(guò)Pull down和免疫共沉淀證實(shí)在睪丸中PRTD-NY2能和G蛋白α亞基12、13及q相互作用。PRTD-NY2作為RGS蛋白，其在睪丸中的作用通過(guò)抑制G蛋白α亞基12、13及q通路而體現(xiàn)。 因此，我們對(duì)Gα12在精子發(fā)生中的作用進(jìn)行了研究。發(fā)現(xiàn)Gα12蛋白表達(dá)在Leydig細(xì)胞以及Sb期開始變形的精子細(xì)胞以后的各級(jí)生精細(xì)胞的細(xì)胞漿中，在精子中主要定位于頸部中心粒以及中段。通過(guò)正常睪丸和精子中F-actin以及α-tubulin與Gα12的共定位研究，提示Gα12可能參與了F-actin和α-tubulin介導(dǎo)的為精子細(xì)胞極性和尾部形成而產(chǎn)生的細(xì)胞骨架重組。非阻塞型無(wú)精癥患者睪丸中Gα12的表達(dá)缺陷可能是導(dǎo)致精子發(fā)生障礙的原因之一。低活力的精子中Gα12表達(dá)異常，并且Gα12的表達(dá)異常主要在中段卷曲的精子中發(fā)生，，提示在精子變形前兩個(gè)階段Gα12產(chǎn)生異�；虿课桓淖�，和／或最后階段的保留異�？赡苁菍�(dǎo)致精子活力低下的原因。PRTD-NY2在精子細(xì)胞漿中有表達(dá)，并且與Gα12相作用，可能協(xié)同參與了精子變形過(guò)程中細(xì)胞極性和尾部形成相關(guān)的細(xì)胞骨架重組。 接著，我們又對(duì)Gα13在精子發(fā)生中的功能進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)人睪丸和精子均有Gα13的表達(dá)，并且小鼠睪丸及精子中Gα13的表達(dá)片段大小與體組織中一致。免疫組化發(fā)現(xiàn)在人和小鼠睪丸中Gα13表達(dá)于精原細(xì)胞和精母細(xì)胞的胞漿而在延伸的精子細(xì)胞的細(xì)胞核；小鼠各級(jí)生精細(xì)胞的免疫熒光也觀察到Gα13從圓形精子細(xì)胞漿隨著精子變形轉(zhuǎn)運(yùn)入核；人精子免疫熒光檢測(cè)證實(shí)Gα13表達(dá)于細(xì)胞核。這些均與Gα13在體組織中的亞細(xì)胞定位不同。Gα13在不育患者的大頭精子中表達(dá)異常，這提示Gα13與精子核的正確變形相關(guān)。通過(guò)PRTD-NY2的睪丸免疫組化和PRTD-NY2片段的亞細(xì)胞定位研究，我們發(fā)現(xiàn)其定位與Gα13高度一致，且其N端具有核定位信號(hào)，提示在核變形的過(guò)程中，睪丸特異的PRTD-NY2可以協(xié)同Gα13從胞漿轉(zhuǎn)運(yùn)至胞核，從而參與了核濃縮。 最后我們對(duì)PRTD-NY2基因在腫瘤發(fā)生過(guò)程中的功能及機(jī)制進(jìn)行探討。96例人腫瘤組織芯片分析，發(fā)現(xiàn)PRTD-NY2蛋白表達(dá)于上皮來(lái)源的腫瘤(主要是鱗狀細(xì)胞癌和腺癌)中。多種鱗癌及腺癌腫瘤組織及食道癌組織芯片的免疫組織化學(xué)、不同遷移能力的腫瘤細(xì)胞系的RT-PCR和Western Blot、超表達(dá)及RNAi PRTD-NY2的腫瘤細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)所致的腫瘤轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)均提示PRTD-NY2與腫瘤的轉(zhuǎn)移相關(guān)，其具有抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的作用。 PRTD-NY2在大腸桿菌和多種腫瘤細(xì)胞中均可通過(guò)不同的翻譯起始位點(diǎn)翻譯為不同片段大小的蛋白。PRTD-NY2在腫瘤細(xì)胞中可表達(dá)146KD片段和76KD片段，能抑制腫瘤細(xì)胞在裸鼠腹腔內(nèi)的種植轉(zhuǎn)移和向遠(yuǎn)處器官肺臟的轉(zhuǎn)移。PRTD-NY2對(duì)腫瘤細(xì)胞的粘附力無(wú)影響，劃痕實(shí)驗(yàn)和transwell實(shí)驗(yàn)均證實(shí)PRTD-NY2能降低腫瘤細(xì)胞在LPA刺激下的遷移。腫瘤細(xì)胞的pull down和LPA刺激的細(xì)胞變形實(shí)驗(yàn)證實(shí)：PRTD-NY2是通過(guò)與Gα12／13相作用，抑制LPA刺激的Gα12／13介導(dǎo)的F-actin的形成。劃痕實(shí)驗(yàn)和transwell實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)僅有76KD片段大小的PRTD-NY2表達(dá)也可顯著抑制腫瘤細(xì)胞在LPA刺激下的遷移，提示76KD的片段可能是PRTD-NY2抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的主要形式。 綜上所述，PRTD-NY2是一個(gè)新CT基因，在睪丸中它能與Gα12、Gα13以及Gαq相互作用，通過(guò)協(xié)同Gα12參與了精子變形中細(xì)胞極性和尾部的形成，并能通過(guò)其核定位信號(hào)協(xié)助Gα13在精子變形過(guò)程中從細(xì)胞漿轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞核，從而參與了核濃縮過(guò)程。在原核和真核細(xì)胞中，PRTD-NY2均可通過(guò)不同的翻譯起始位點(diǎn)翻譯為不同片段大小的蛋白。它是通過(guò)與Gα12／13相作用，抑制LPA刺激的Gα12／13介導(dǎo)的F-actin的形成，抑制腫瘤細(xì)胞遷移和腫瘤轉(zhuǎn)移。
【圖文】：

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【學(xué)位授予單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號(hào)】：R346;R73-3

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