【摘要】： 【背景和目的】 幾丁質(zhì)又稱(chēng)甲殼素，在昆蟲(chóng)、甲殼類(lèi)動(dòng)物外骨骼、真菌細(xì)胞壁及某些綠藻中廣泛存在，，是自然界中僅次子纖維素的含量最豐富的生物資源。幾丁質(zhì)及其部分脫乙�；a(chǎn)物殼聚糖具多種生理功能，如抑瘤、抗菌、免疫增強(qiáng)等。但是他們的高粘度和低水溶性極大地限制了其在體內(nèi)的應(yīng)用。于是低分子量的降解產(chǎn)物殼寡糖以其良好的水溶性和無(wú)毒性及良好的組織相容性日漸受到重視。 已有文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)殼寡糖在整體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中能激活巨噬細(xì)胞，增強(qiáng)其殺傷活性，并誘導(dǎo)如白介素—1(IL-1)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、粒單核集落刺激因子(GM-CSF)、白介素-6(IL-6)等細(xì)胞因子的分泌，增強(qiáng)T細(xì)胞和NK細(xì)胞的活性。但殼寡糖與巨噬細(xì)胞的結(jié)合機(jī)制，特別是關(guān)于殼寡糖在巨噬細(xì)胞表面的受體報(bào)導(dǎo)甚少。 本實(shí)驗(yàn)室前期將甘露聚糖(甘露糖受體的配體)用熒光物質(zhì)進(jìn)行標(biāo)記，觀察其在其它甘露糖受體的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑及殼寡糖存在的情況下，與小鼠RAW264.7巨噬細(xì)胞的結(jié)合情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明殼寡糖可競(jìng)爭(zhēng)性抑制巨噬細(xì)胞內(nèi)吞甘露聚糖，抑制作用強(qiáng)達(dá)44％。 本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步使用RNA干擾的方法，沉默甘露糖受體在RAW264.7巨噬細(xì)胞中的表達(dá)，從而研究殼寡糖與巨噬細(xì)胞結(jié)合情況。 【材料和方法】 (一)PGCsi-U6／Neo／DsRed質(zhì)粒載體的構(gòu)建 1．設(shè)計(jì)siRNA：采用Ambion公司siRNA在線軟件設(shè)計(jì)3條靶序列和1條打亂部分堿基順序的隨機(jī)陰性對(duì)照序列。 2．合成DNA oligos，此DNA oligos含有靶基因的siRNA序列。 3．用BamHⅠ和HindⅢ酶切pGCsi載體以使其線性化。 4．將DNA oligos接入載體。 5．測(cè)序鑒定確定構(gòu)建成功。 6．將載體轉(zhuǎn)導(dǎo)入DH5α細(xì)菌中擴(kuò)增并純化。 7．將pGCsi載體轉(zhuǎn)染入RAW264.7巨噬細(xì)胞表達(dá)。 8．檢測(cè)ERFP的熒光。 9．檢測(cè)mRNA及蛋白水平的基因抑制效率。 (二)異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記殼寡糖 將殼寡糖溶于醋酸緩沖溶液(0.2 mol／L CH_3COOH+O.1 mol／L CH_3COONa)調(diào)整其pH值至7.7，定容得到1％殼寡糖溶液。取10ml此溶液，室溫下150rpm振蕩恒溫30min后，迅速加入一定量的FITC溶液(溶劑為甲醇)，具塞，繼續(xù)以同樣振蕩速度在4℃條件下反應(yīng)24小時(shí)。離心取上清，裝入截留的相對(duì)分子質(zhì)量為1000的透析袋內(nèi)置PH 7.4的PBS中4℃避光透析，每天更換PBS三次，直至透析外液在紫外照射下無(wú)熒光為止。冷凍干燥后溶解在c-PBS緩沖液中。取少量，測(cè)標(biāo)記物的熒光物質(zhì)(F)與蛋白(P)結(jié)合比率F／P=OD 495nm／OD 280nm，確定糖的標(biāo)記效率。 (三)流式細(xì)胞儀分析FITC標(biāo)記的殼寡糖與巨噬細(xì)胞結(jié)合顯示的熒光強(qiáng)度 在培養(yǎng)瓶(或培養(yǎng)板)中加入一定量的溶于c-PBS的FITC標(biāo)記的殼寡糖，避光孵育特定時(shí)間。用刮除法將貼壁的巨噬細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，3000rpm離心5分鐘去除未結(jié)合的FITC標(biāo)記的殼寡糖，后重新懸浮于c-PBS緩沖液中，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×10~6／ml。結(jié)合了FITC標(biāo)記的殼寡糖的細(xì)胞的熒光強(qiáng)度用BD-LSR流式細(xì)胞儀的Cell Quest軟件檢測(cè)。 【結(jié)果】 1．成功構(gòu)建抑制巨噬細(xì)胞甘露糖受體的siRNA質(zhì)粒表達(dá)載體Mrc1-1、Mrc1-2、Mrc1-3和打亂序列的陰性對(duì)照Non質(zhì)粒； 2．Mrc1-1質(zhì)粒、Mrc1-2質(zhì)粒、Mrc1-3質(zhì)粒顯著抑制甘露糖受體在巨噬細(xì)胞RAW264.7上的表達(dá)； 3．Mrc1-3質(zhì)粒干擾后巨噬細(xì)胞與殼寡糖結(jié)合明顯下降。 【結(jié)論】殼寡糖可以通過(guò)甘露糖受體與巨噬細(xì)胞結(jié)合。
【圖文】：

RAW264.7巨噬細(xì)胞選用DMEM培養(yǎng)液進(jìn)行貼壁生長(zhǎng)培養(yǎng)，生長(zhǎng)狀況良好，形態(tài)佳，一般其大小在20一 50um，有特殊的細(xì)胞核和皺褶的細(xì)胞質(zhì)，呈圓形、星形或梭形。見(jiàn)圖4。

2007浙江大學(xué)碩士學(xué)位論文白水平干擾效率檢測(cè)結(jié)果質(zhì)粒轉(zhuǎn)染72小時(shí)后，加標(biāo)記FITC的抗甘露糖受體抗體，，未轉(zhuǎn)染組細(xì)胞結(jié)合抗體后熒光強(qiáng)度為3.76，轉(zhuǎn)染Mrcl一熒光強(qiáng)度為1.27，轉(zhuǎn)染Mrcl一2質(zhì)粒組細(xì)胞結(jié)合抗體后熒rcl一3質(zhì)粒組細(xì)胞結(jié)合抗體后熒光強(qiáng)度為1.23，而轉(zhuǎn)染無(wú)關(guān)結(jié)合抗體后熒光強(qiáng)度為3.71，見(jiàn)圖6。結(jié)果表明，Mrcl一Mrcl一3質(zhì)粒均明顯抑制甘露糖受體的表達(dá)，其中Mrel一3質(zhì)粒關(guān)序列質(zhì)粒Non質(zhì)粒對(duì)甘露糖受體的表達(dá)無(wú)顯著影響。
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類(lèi)號(hào)】：R346

【引證文獻(xiàn)】

相關(guān)博士學(xué)位論文 前1條

1 殷黎晨;用于改善生物大分子藥物功效的超多孔水凝膠、納米粒新型給藥載體[D];復(fù)旦大學(xué);2010年

本文編號(hào)：2562905