【摘要】： 【背景和目的】 幾丁質(zhì)又稱甲殼素，在昆蟲、甲殼類動物外骨骼、真菌細(xì)胞壁及某些綠藻中廣泛存在，，是自然界中僅次子纖維素的含量最豐富的生物資源。幾丁質(zhì)及其部分脫乙酰化產(chǎn)物殼聚糖具多種生理功能，如抑瘤、抗菌、免疫增強等。但是他們的高粘度和低水溶性極大地限制了其在體內(nèi)的應(yīng)用。于是低分子量的降解產(chǎn)物殼寡糖以其良好的水溶性和無毒性及良好的組織相容性日漸受到重視。 已有文獻報導(dǎo)殼寡糖在整體動物實驗中能激活巨噬細(xì)胞，增強其殺傷活性，并誘導(dǎo)如白介素—1(IL-1)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、粒單核集落刺激因子(GM-CSF)、白介素-6(IL-6)等細(xì)胞因子的分泌，增強T細(xì)胞和NK細(xì)胞的活性。但殼寡糖與巨噬細(xì)胞的結(jié)合機制，特別是關(guān)于殼寡糖在巨噬細(xì)胞表面的受體報導(dǎo)甚少。 本實驗室前期將甘露聚糖(甘露糖受體的配體)用熒光物質(zhì)進行標(biāo)記，觀察其在其它甘露糖受體的競爭性抑制劑及殼寡糖存在的情況下，與小鼠RAW264.7巨噬細(xì)胞的結(jié)合情況。實驗結(jié)果表明殼寡糖可競爭性抑制巨噬細(xì)胞內(nèi)吞甘露聚糖，抑制作用強達44％。 本實驗進一步使用RNA干擾的方法，沉默甘露糖受體在RAW264.7巨噬細(xì)胞中的表達，從而研究殼寡糖與巨噬細(xì)胞結(jié)合情況。 【材料和方法】 (一)PGCsi-U6／Neo／DsRed質(zhì)粒載體的構(gòu)建 1．設(shè)計siRNA：采用Ambion公司siRNA在線軟件設(shè)計3條靶序列和1條打亂部分堿基順序的隨機陰性對照序列。 2．合成DNA oligos，此DNA oligos含有靶基因的siRNA序列。 3．用BamHⅠ和HindⅢ酶切pGCsi載體以使其線性化。 4．將DNA oligos接入載體。 5．測序鑒定確定構(gòu)建成功。 6．將載體轉(zhuǎn)導(dǎo)入DH5α細(xì)菌中擴增并純化。 7．將pGCsi載體轉(zhuǎn)染入RAW264.7巨噬細(xì)胞表達。 8．檢測ERFP的熒光。 9．檢測mRNA及蛋白水平的基因抑制效率。 (二)異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記殼寡糖 將殼寡糖溶于醋酸緩沖溶液(0.2 mol／L CH_3COOH+O.1 mol／L CH_3COONa)調(diào)整其pH值至7.7，定容得到1％殼寡糖溶液。取10ml此溶液，室溫下150rpm振蕩恒溫30min后，迅速加入一定量的FITC溶液(溶劑為甲醇)，具塞，繼續(xù)以同樣振蕩速度在4℃條件下反應(yīng)24小時。離心取上清，裝入截留的相對分子質(zhì)量為1000的透析袋內(nèi)置PH 7.4的PBS中4℃避光透析，每天更換PBS三次，直至透析外液在紫外照射下無熒光為止。冷凍干燥后溶解在c-PBS緩沖液中。取少量，測標(biāo)記物的熒光物質(zhì)(F)與蛋白(P)結(jié)合比率F／P=OD 495nm／OD 280nm，確定糖的標(biāo)記效率。 (三)流式細(xì)胞儀分析FITC標(biāo)記的殼寡糖與巨噬細(xì)胞結(jié)合顯示的熒光強度 在培養(yǎng)瓶(或培養(yǎng)板)中加入一定量的溶于c-PBS的FITC標(biāo)記的殼寡糖，避光孵育特定時間。用刮除法將貼壁的巨噬細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，3000rpm離心5分鐘去除未結(jié)合的FITC標(biāo)記的殼寡糖，后重新懸浮于c-PBS緩沖液中，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×10~6／ml。結(jié)合了FITC標(biāo)記的殼寡糖的細(xì)胞的熒光強度用BD-LSR流式細(xì)胞儀的Cell Quest軟件檢測。 【結(jié)果】 1．成功構(gòu)建抑制巨噬細(xì)胞甘露糖受體的siRNA質(zhì)粒表達載體Mrc1-1、Mrc1-2、Mrc1-3和打亂序列的陰性對照Non質(zhì)粒； 2．Mrc1-1質(zhì)粒、Mrc1-2質(zhì)粒、Mrc1-3質(zhì)粒顯著抑制甘露糖受體在巨噬細(xì)胞RAW264.7上的表達； 3．Mrc1-3質(zhì)粒干擾后巨噬細(xì)胞與殼寡糖結(jié)合明顯下降。 【結(jié)論】殼寡糖可以通過甘露糖受體與巨噬細(xì)胞結(jié)合。
【圖文】：

RAW264.7巨噬細(xì)胞選用DMEM培養(yǎng)液進行貼壁生長培養(yǎng)，生長狀況良好，形態(tài)佳，一般其大小在20一 50um，有特殊的細(xì)胞核和皺褶的細(xì)胞質(zhì)，呈圓形、星形或梭形。見圖4。

2007浙江大學(xué)碩士學(xué)位論文白水平干擾效率檢測結(jié)果質(zhì)粒轉(zhuǎn)染72小時后，加標(biāo)記FITC的抗甘露糖受體抗體，，未轉(zhuǎn)染組細(xì)胞結(jié)合抗體后熒光強度為3.76，轉(zhuǎn)染Mrcl一熒光強度為1.27，轉(zhuǎn)染Mrcl一2質(zhì)粒組細(xì)胞結(jié)合抗體后熒rcl一3質(zhì)粒組細(xì)胞結(jié)合抗體后熒光強度為1.23，而轉(zhuǎn)染無關(guān)結(jié)合抗體后熒光強度為3.71，見圖6。結(jié)果表明，Mrcl一Mrcl一3質(zhì)粒均明顯抑制甘露糖受體的表達，其中Mrel一3質(zhì)粒關(guān)序列質(zhì)粒Non質(zhì)粒對甘露糖受體的表達無顯著影響。
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號】：R346

【引證文獻】

相關(guān)博士學(xué)位論文 前1條

1 殷黎晨;用于改善生物大分子藥物功效的超多孔水凝膠、納米粒新型給藥載體[D];復(fù)旦大學(xué);2010年

本文編號：2562905