【摘要】： 研究背景： 肝細(xì)胞屬于高度分化的多功能、實(shí)質(zhì)性臟器細(xì)胞。肝細(xì)胞離體后，在不適宜環(huán)境中很快出現(xiàn)低功能、去分化甚至死亡，如缺少肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)、表皮生長(zhǎng)因子(EGF)等引起細(xì)胞衰老和失功能，pH值不適和無(wú)激素支持導(dǎo)致細(xì)胞死亡，基因的激活造成細(xì)胞凋亡等。 隨著近代細(xì)胞工程學(xué)的進(jìn)展，細(xì)胞生物學(xué)、組織培養(yǎng)技術(shù)、生物學(xué)技術(shù)的最新成就，肝細(xì)胞作為構(gòu)建生物人工肝的生物部分，作為細(xì)胞移植治療急慢性肝衰竭的種子細(xì)胞以及作為藥物篩選的靶細(xì)胞，，成為目前研究的熱點(diǎn)，而制備和培養(yǎng)大量的、高質(zhì)量的肝細(xì)胞是這些研究的最基本環(huán)節(jié)。 肝細(xì)胞分離方法有多種：機(jī)械分離法、螯合法和酶消化法等。最初的機(jī)械分離法始于半個(gè)多世紀(jì)前，1956年Sorrentino第一次用機(jī)械的方法把新鮮肝組織制成勻漿，并在體外進(jìn)行藥物解毒試驗(yàn)，證實(shí)了它有代謝水楊酸、巴比妥鈉、酮體的能力，同時(shí)還證實(shí)了它能夠利用氨合成尿素。但機(jī)械分離法獲得的肝細(xì)胞，細(xì)胞數(shù)量少、活性差，現(xiàn)已很少被使用。1967年Howard創(chuàng)建了膠原酶灌流法，后經(jīng)Berry和Friend等人的改良，采用無(wú)鈣的平衡鹽、膠原酶和透明質(zhì)酸酶配制成的消化液進(jìn)行灌流，獲得的肝細(xì)胞的數(shù)量和活性均優(yōu)于機(jī)械分離法。1972年Seglen進(jìn)一步將這種方法發(fā)展為兩步灌流法，即首先灌注預(yù)熱的無(wú)鈣平衡鹽溶液，以去除肝血竇內(nèi)的血細(xì)胞及部分非實(shí)質(zhì)細(xì)胞，然后再灌注含有膠原酶的平衡鹽溶液，進(jìn)行體外消化后，分離提純而獲得肝細(xì)胞。用此法獲得的肝細(xì)胞，細(xì)胞數(shù)量和活性都得到了提高，而且減少了肝細(xì)胞懸液中的雜質(zhì)。肝細(xì)胞的二步灌流法也成為目前實(shí)驗(yàn)室常用的方法。 二步灌流法適合中小型動(dòng)物如小鼠、大鼠、兔及犬等動(dòng)物肝臟的分離。豬的肝臟因含有更多的膠原及纖維組織，人的肝臟體積較大，用二步分離法分離效果不佳。而生物人工肝和細(xì)胞移植等研究需要大規(guī)模制備高質(zhì)量肝細(xì)胞。因此建立從豬等較大動(dòng)物臟器和人肝臟分離肝細(xì)胞的細(xì)胞分離技術(shù)成為必需。 本研究以二步灌流法為對(duì)照，建立四步灌流的新方法，為獲得高質(zhì)量的肝細(xì)胞提供新途徑。 材料和方法： 中性蛋白酶(Dispase)、DNA酶(DNase)和牛血清白蛋白(BSA)購(gòu)自美國(guó)羅氏公司；Ⅳ型膠原酶(typeⅣcollagenase)、谷胺酰胺(Glutamine)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；Walliams' E購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；葡萄糖(Glucose)、羥乙基哌嗪乙磺酸(Hepes)、碳酸氫鈉(NaHCO_3)、氯化鈉(NaCl)、氯化鉀(KCl)、磷酸二氫鉀(KH_2PO_3)、磷酸氫二鈉(Na_2HPO_4·7H_2O)、氯化鈣(CaCl_2·2H_2O)、臺(tái)盼藍(lán)、氯化鎂(MgCl_2·6H_2O)、硫酸鎂(MgSO_4·7H_2O)、胰蛋白酶(Trypsin)和乙二胺四乙酸(EDTA·4Na)購(gòu)自上海生物工程技術(shù)公司公司；胎牛血清(FBS)購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司；肝素購(gòu)自上海第一生化藥業(yè)有限公司；培養(yǎng)瓶和培養(yǎng)板為丹麥Nunc公司產(chǎn)品；0.22μm過(guò)濾器為德國(guó)Millipore公司產(chǎn)品。中國(guó)小型豬購(gòu)自北京農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)豬場(chǎng)。 實(shí)驗(yàn)儀器包括Olympus倒置相差顯微鏡、日本HITACHI H-600A透射電鏡、美國(guó)Forma二氧化碳培養(yǎng)箱、美國(guó)Thermo液氮儲(chǔ)存罐、德國(guó)Sartorius酸度計(jì)和電子天平、德國(guó)Millipore超純水儀、德國(guó)Scotsman制冰機(jī)、日本HITACHI立式大容量低溫離心機(jī)、日本Tomy蒸汽消毒鍋、德國(guó)Eppendorf蠕動(dòng)泵、上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司電熱恒溫水浴箱、杭州儀表電機(jī)廠磁力加熱攪拌器等，80目和150目不銹鋼網(wǎng)篩購(gòu)自華東醫(yī)藥股份有限公司，體外灌流裝置自行設(shè)計(jì)。 無(wú)菌手術(shù)取中國(guó)小型豬肝臟，用含EDTA、膠原酶等灌流液進(jìn)行常規(guī)的體外二步灌流法分離豬肝細(xì)胞。 同樣方法取肝后，將肝臟放在不銹鋼盆中，輕輕擠壓肝臟，用4℃預(yù)冷的灌流緩沖液(PB)500ml盡可能多地沖洗去肝臟外部血液和大血管中殘留的血液。第一步經(jīng)蠕動(dòng)泵向肝臟中連續(xù)灌注常溫的含EDTA的灌流緩沖液(PBE)300ml、預(yù)熱至39℃的PBE液700ml；第二步灌注預(yù)熱至39℃的含Hepes的PB液500ml；棄去上述灌流液，將肝臟轉(zhuǎn)于新的無(wú)菌不銹鋼盆中，第三步灌注預(yù)熱39℃的含Dispase的灌流緩沖液(PBD)500ml，第四步棄去其中約200ml灌流液，繼續(xù)用預(yù)熱至39℃的含膠原酶的灌流緩沖液(PBC)500ml灌流，這500mlPBC液和約300ml的PBD液重復(fù)循環(huán)灌注，直至肝包膜分離；摘除膽囊，銳性撕裂肝包膜，去除纖維結(jié)締組織，在冰浴條件下用80目和150目不銹鋼網(wǎng)篩過(guò)濾肝細(xì)胞，收集肝細(xì)胞懸液。 洗滌兩種灌流法收集的肝細(xì)胞，臺(tái)盼藍(lán)染色，計(jì)算肝細(xì)胞的活率和得率。用William's Medium E培養(yǎng)肝細(xì)胞，計(jì)算肝細(xì)胞24h貼壁率。 結(jié)果： 采用自行設(shè)計(jì)的體外灌流系統(tǒng)，對(duì)中國(guó)小型豬肝臟進(jìn)行常規(guī)的膠原酶兩步灌流和我們創(chuàng)建的四步灌流法分離肝細(xì)胞。二步法分離肝細(xì)胞的活率是88％±5％，后者為95％±4％；二步法分離得到的肝細(xì)胞總數(shù)是(3.1±0.7)×10~7／克肝組織，四步灌流法所得的分離細(xì)胞總數(shù)為(5.3±1.1)×10~7／克肝組織；二步灌流法分離的肝細(xì)胞貼壁率為80％，四步灌流法獲得的肝細(xì)胞貼壁率達(dá)90％以上。四步分離法分離得到肝細(xì)胞的活率、得率和24h貼壁率顯著高于二步灌流法(P＜0.05)，且細(xì)胞碎片和其它非實(shí)質(zhì)細(xì)胞污染極少，鏡下觀察非實(shí)質(zhì)細(xì)胞污染率低。 結(jié)論： 四步灌流法分離肝細(xì)胞，可獲得更高的細(xì)胞活率和得率，對(duì)于培養(yǎng)后的細(xì)胞貼壁也有明顯促進(jìn)作用，且細(xì)胞碎片和其它非實(shí)質(zhì)細(xì)胞污染極少。該法可廣泛應(yīng)用于生物人工肝用肝細(xì)胞的分離和其他大規(guī)模分離肝細(xì)胞的研究。為生物人工肝、細(xì)胞移植和藥物篩選等研究提供高質(zhì)量的肝細(xì)胞。
【圖文】：

4透射電鏡觀察培養(yǎng)24h的肝細(xì)胞(x4200)，N為細(xì)胞核，M為線細(xì)胞生長(zhǎng)曲線分離的豬肝細(xì)胞培養(yǎng)7天，采用細(xì)胞記數(shù)法觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)見(jiàn)圖5。600000500000400000300000200000100000
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類(lèi)號(hào)】：R329.2

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2562104