【摘要】： 研究背景： 肝細胞屬于高度分化的多功能、實質(zhì)性臟器細胞。肝細胞離體后，在不適宜環(huán)境中很快出現(xiàn)低功能、去分化甚至死亡，如缺少肝細胞生長因子(HGF)、表皮生長因子(EGF)等引起細胞衰老和失功能，pH值不適和無激素支持導致細胞死亡，基因的激活造成細胞凋亡等。 隨著近代細胞工程學的進展，細胞生物學、組織培養(yǎng)技術、生物學技術的最新成就，肝細胞作為構(gòu)建生物人工肝的生物部分，作為細胞移植治療急慢性肝衰竭的種子細胞以及作為藥物篩選的靶細胞，，成為目前研究的熱點，而制備和培養(yǎng)大量的、高質(zhì)量的肝細胞是這些研究的最基本環(huán)節(jié)。 肝細胞分離方法有多種：機械分離法、螯合法和酶消化法等。最初的機械分離法始于半個多世紀前，1956年Sorrentino第一次用機械的方法把新鮮肝組織制成勻漿，并在體外進行藥物解毒試驗，證實了它有代謝水楊酸、巴比妥鈉、酮體的能力，同時還證實了它能夠利用氨合成尿素。但機械分離法獲得的肝細胞，細胞數(shù)量少、活性差，現(xiàn)已很少被使用。1967年Howard創(chuàng)建了膠原酶灌流法，后經(jīng)Berry和Friend等人的改良，采用無鈣的平衡鹽、膠原酶和透明質(zhì)酸酶配制成的消化液進行灌流，獲得的肝細胞的數(shù)量和活性均優(yōu)于機械分離法。1972年Seglen進一步將這種方法發(fā)展為兩步灌流法，即首先灌注預熱的無鈣平衡鹽溶液，以去除肝血竇內(nèi)的血細胞及部分非實質(zhì)細胞，然后再灌注含有膠原酶的平衡鹽溶液，進行體外消化后，分離提純而獲得肝細胞。用此法獲得的肝細胞，細胞數(shù)量和活性都得到了提高，而且減少了肝細胞懸液中的雜質(zhì)。肝細胞的二步灌流法也成為目前實驗室常用的方法。 二步灌流法適合中小型動物如小鼠、大鼠、兔及犬等動物肝臟的分離。豬的肝臟因含有更多的膠原及纖維組織，人的肝臟體積較大，用二步分離法分離效果不佳。而生物人工肝和細胞移植等研究需要大規(guī)模制備高質(zhì)量肝細胞。因此建立從豬等較大動物臟器和人肝臟分離肝細胞的細胞分離技術成為必需。 本研究以二步灌流法為對照，建立四步灌流的新方法，為獲得高質(zhì)量的肝細胞提供新途徑。 材料和方法： 中性蛋白酶(Dispase)、DNA酶(DNase)和牛血清白蛋白(BSA)購自美國羅氏公司；Ⅳ型膠原酶(typeⅣcollagenase)、谷胺酰胺(Glutamine)購自美國Sigma公司；Walliams' E購自美國Gibco公司；葡萄糖(Glucose)、羥乙基哌嗪乙磺酸(Hepes)、碳酸氫鈉(NaHCO_3)、氯化鈉(NaCl)、氯化鉀(KCl)、磷酸二氫鉀(KH_2PO_3)、磷酸氫二鈉(Na_2HPO_4·7H_2O)、氯化鈣(CaCl_2·2H_2O)、臺盼藍、氯化鎂(MgCl_2·6H_2O)、硫酸鎂(MgSO_4·7H_2O)、胰蛋白酶(Trypsin)和乙二胺四乙酸(EDTA·4Na)購自上海生物工程技術公司公司；胎牛血清(FBS)購自美國Hyclone公司；肝素購自上海第一生化藥業(yè)有限公司；培養(yǎng)瓶和培養(yǎng)板為丹麥Nunc公司產(chǎn)品；0.22μm過濾器為德國Millipore公司產(chǎn)品。中國小型豬購自北京農(nóng)業(yè)大學實驗豬場。 實驗儀器包括Olympus倒置相差顯微鏡、日本HITACHI H-600A透射電鏡、美國Forma二氧化碳培養(yǎng)箱、美國Thermo液氮儲存罐、德國Sartorius酸度計和電子天平、德國Millipore超純水儀、德國Scotsman制冰機、日本HITACHI立式大容量低溫離心機、日本Tomy蒸汽消毒鍋、德國Eppendorf蠕動泵、上海精宏實驗設備有限公司電熱恒溫水浴箱、杭州儀表電機廠磁力加熱攪拌器等，80目和150目不銹鋼網(wǎng)篩購自華東醫(yī)藥股份有限公司，體外灌流裝置自行設計。 無菌手術取中國小型豬肝臟，用含EDTA、膠原酶等灌流液進行常規(guī)的體外二步灌流法分離豬肝細胞。 同樣方法取肝后，將肝臟放在不銹鋼盆中，輕輕擠壓肝臟，用4℃預冷的灌流緩沖液(PB)500ml盡可能多地沖洗去肝臟外部血液和大血管中殘留的血液。第一步經(jīng)蠕動泵向肝臟中連續(xù)灌注常溫的含EDTA的灌流緩沖液(PBE)300ml、預熱至39℃的PBE液700ml；第二步灌注預熱至39℃的含Hepes的PB液500ml；棄去上述灌流液，將肝臟轉(zhuǎn)于新的無菌不銹鋼盆中，第三步灌注預熱39℃的含Dispase的灌流緩沖液(PBD)500ml，第四步棄去其中約200ml灌流液，繼續(xù)用預熱至39℃的含膠原酶的灌流緩沖液(PBC)500ml灌流，這500mlPBC液和約300ml的PBD液重復循環(huán)灌注，直至肝包膜分離；摘除膽囊，銳性撕裂肝包膜，去除纖維結(jié)締組織，在冰浴條件下用80目和150目不銹鋼網(wǎng)篩過濾肝細胞，收集肝細胞懸液。 洗滌兩種灌流法收集的肝細胞，臺盼藍染色，計算肝細胞的活率和得率。用William's Medium E培養(yǎng)肝細胞，計算肝細胞24h貼壁率。 結(jié)果： 采用自行設計的體外灌流系統(tǒng)，對中國小型豬肝臟進行常規(guī)的膠原酶兩步灌流和我們創(chuàng)建的四步灌流法分離肝細胞。二步法分離肝細胞的活率是88％±5％，后者為95％±4％；二步法分離得到的肝細胞總數(shù)是(3.1±0.7)×10~7／克肝組織，四步灌流法所得的分離細胞總數(shù)為(5.3±1.1)×10~7／克肝組織；二步灌流法分離的肝細胞貼壁率為80％，四步灌流法獲得的肝細胞貼壁率達90％以上。四步分離法分離得到肝細胞的活率、得率和24h貼壁率顯著高于二步灌流法(P＜0.05)，且細胞碎片和其它非實質(zhì)細胞污染極少，鏡下觀察非實質(zhì)細胞污染率低。 結(jié)論： 四步灌流法分離肝細胞，可獲得更高的細胞活率和得率，對于培養(yǎng)后的細胞貼壁也有明顯促進作用，且細胞碎片和其它非實質(zhì)細胞污染極少。該法可廣泛應用于生物人工肝用肝細胞的分離和其他大規(guī)模分離肝細胞的研究。為生物人工肝、細胞移植和藥物篩選等研究提供高質(zhì)量的肝細胞。
【圖文】：

4透射電鏡觀察培養(yǎng)24h的肝細胞(x4200)，N為細胞核，M為線細胞生長曲線分離的豬肝細胞培養(yǎng)7天，采用細胞記數(shù)法觀察細胞的生長見圖5。600000500000400000300000200000100000
【學位授予單位】：浙江大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2007
【分類號】：R329.2

【共引文獻】

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本文編號：2562104