【摘要】： 增殖誘導(dǎo)配體(a proliferation-inducing ligand，APRIL)是1998年發(fā)現(xiàn)的TNF超家族的一個新成員。人APRIL編碼基因定位于染色體17p13.1，mRNA全長2.1 kb。APRIL共250個氨基酸，屬Ⅱ型跨膜蛋白，其主要作用是促進腫瘤細胞增殖，調(diào)節(jié)體液免疫，并參與T、B細胞的成熟和活化。它主要表達于免疫細胞，包括單核巨噬細胞、樹突狀細胞及T細胞，并且高表達于多種腫瘤細胞。 APRIL與TNF超家族中另一個成員B細胞激活因子(B cell activating factor belonging to the TNF family，BAFF)的胞外區(qū)有48％的同源性，并且二者競爭性結(jié)合受體BCMA和TACI。已有研究證明，BAFF與相應(yīng)受體結(jié)合引起的細胞內(nèi)信號級聯(lián)反應(yīng)影響B(tài)細胞的存活，APRIL則通過結(jié)合B細胞上的BCMA和TACI調(diào)節(jié)B細胞增生。有文獻報道，SLE患者血清中BAFF與APRIL的水平都明顯升高，并與抗dsDNA抗體的出現(xiàn)相關(guān)。這些證據(jù)提示，APRIL／BAFF與BCMA／TACI形成的雙受體一雙配體系統(tǒng)，在SLE等自身免疫病的發(fā)生和發(fā)展過程中都起了重要作用。本文制備了抗人APRIL的單克隆抗體，為日后闡明APRIL的生物學(xué)意義及SLE等自身免疫病的發(fā)病機理提供了有利工具。 本論文包括兩部分。在第一部分中，我們利用人的外周血單個核細胞的cDNA為模板，分別克隆了APRIL的全長、胞外區(qū)及其可溶形式，并將APRIL基因重組到原核表達載體pET-30a(+)的NdeⅠ和HindⅢ兩酶切位點之間。陽性重組子在大腸桿菌BL21(DE3)及BL21-CodonPlus-RIL中進行IPTG誘導(dǎo)表達，誘導(dǎo)后的重組蛋白以包涵體形式出現(xiàn)，，經(jīng)鎳柱親和層析純化后，用來免疫小鼠制備抗人APRIL的單克隆抗體。進而，通過陽性檢測及亞克隆篩選，得到分泌特異性抗體的雜交瘤細胞株，以便為后續(xù)研究奠定基礎(chǔ)。 在第二部分中，通過比較三種免疫檢測方法的靈敏度，為后免疫檢測工作提供了參考。利用生物素—鏈親和素放大系統(tǒng)的BA-ELISA，可以使雙抗夾心ELISA的靈敏度大大提高，但有些抗體會因生物素標(biāo)記導(dǎo)致活性降低，可能是由于生物素結(jié)合的位置正好是抗原結(jié)合位點或離抗原結(jié)合位點很近，從而影響了其活性。而將ELISA的酶顯色轉(zhuǎn)變?yōu)镻CR產(chǎn)物檢測的免疫PCR，也能大大提高ELISA檢測的靈敏度，但由于步驟繁瑣，易引起較大誤差，從而限制了在國內(nèi)的大規(guī)模應(yīng)用。
【圖文】：

圖1.1人APRIL的氨基酸序列RIL主要由樹突狀細胞、巨噬細胞和單核細胞分泌，以可溶性形式正常組織中表達弱，僅見于前列腺、淋巴細胞、單核/巨噬細胞、結(jié)織，但在多種腫瘤組織(尤其是直腸、結(jié)腸、十二指腸、胃、食管)和腫瘤細胞系(如直腸癌細胞系sW480、淋巴瘤細胞系Raji、36等)中有高表達川。己確認的APRIL的2個受體是BCMA(Beellmaturationantigen)embraneaetivatorandCAMLinteractor)141。人BCMA是一個全長由的非糖基化單鏈蛋白，為I型跨膜蛋白，其胞外N端有一含6個半人TACI是一個全長為293個氨基酸的111型跨膜蛋白，N端無信為54%，最早是在研究鈣調(diào)控因子和親環(huán)素配體(calciulnmoduinhgand，cAML)蛋白介導(dǎo)的NF一AT活化機制中發(fā)現(xiàn)的。TACI胞

圖1.2APRIL、BAFF及其受體發(fā)現(xiàn)APRIL可明顯促進不表達BCMA和1’ACI的未活化一3T3和多種腫瘤細胞(如人腺癌細胞系HT29、肺癌A5驗證明這些細胞對BAFF沒有反應(yīng)，這說明在這些細胞上存體，它不能與BAFF結(jié)合。2005年，Hendriks等發(fā)現(xiàn)了HSPG(heParansulfateprotcoglycan)，它可以促進腫瘤細細胞和B細胞161。通過上調(diào)X相關(guān)凋亡蛋白抑制因子(X一hnkedmarnrnaliein，XIAp)和誘導(dǎo)Bel一2和Bel一xl表達增加促進某些腫瘤。研究發(fā)現(xiàn)sAPRIL在體外以劑量依賴方式促進人直腸巴瘤細胞株Raji等腫瘤細胞增殖。將轉(zhuǎn)染APRIL基因的RIL基因的NIH一3T3細胞接種到裸鼠體內(nèi)，前者較后者的
【學(xué)位授予單位】：中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號】：R392;R446.6

【參考文獻】

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1 陳志強,李子仁,范江,岳曉玉,徐文嚴;系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者外周血單一核細胞中Th1型細胞因子的表達[J];中華皮膚科雜志;1999年01期

本文編號：2555578