【摘要】： 目的： 采用伴刀豆球蛋白(Concanavalin A，ConA)活化淋巴細(xì)胞提取的染色質(zhì)免疫同系小鼠，摸索建立穩(wěn)定的系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)樣自身免疫反應(yīng)亢進(jìn)小鼠模型方法，并進(jìn)一步觀察模型的各項(xiàng)指標(biāo)的變化，使模型標(biāo)準(zhǔn)化。通過觀察雷公藤紅素和潑尼松對(duì)SLE樣自身免疫反應(yīng)亢進(jìn)小鼠模型的作用，對(duì)該模型進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證。觀察雷公藤紅素對(duì)佐劑性關(guān)節(jié)炎的治療作用。通過觀察紅素對(duì)兩種不同的自身免疫性疾病模型的治療作用，進(jìn)一步了解雷公藤紅素抗炎免疫作用機(jī)制。 方法： ConA活化的BALB／c小鼠脾細(xì)胞中提取活性染色質(zhì)。以染色質(zhì)100μg／只d0、d14、d28背部皮內(nèi)注射免疫同系小鼠三次，建立SLE樣自身免疫反應(yīng)亢進(jìn)小鼠模型。通過酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測(cè)定血清中抗雙鏈DNA(dsDNA)、抗單鏈DNA(ssDNA)、抗組蛋白抗體和總IgG的動(dòng)態(tài)變化，，用Hep-2細(xì)胞作抗核抗體核型的檢測(cè)。觀察脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化，用ELISA法測(cè)定血清中腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的水平、脾淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清中干擾素-γ(IFN-γ)的水平，脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)誘導(dǎo)腹腔巨噬細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α的水平。用硝酸還原酶比色法檢測(cè)亞硝酸鹽含量以反映血清一氧化氮(NO)水平。用50％溶血試驗(yàn)法測(cè)定血清中總補(bǔ)體含量。進(jìn)行了紅細(xì)胞、白細(xì)胞、血小板的計(jì)數(shù)。通過尿蛋白檢測(cè)，免疫組化及光鏡觀察腎臟病理?yè)p傷。 ConA活化同系小鼠脾淋巴細(xì)胞提取的染色質(zhì)，d0免疫BALB／c小鼠誘發(fā)紅斑狼瘡(SLE)樣綜合征，醋酸潑尼松(Prednisone 5 mg·kg~(-1)·d~(-1))、雷公藤紅素(Tripterine 6、12 mg·kg(-1)·d~(-1))灌胃給藥(d35-d50)，觀察雷公藤紅素對(duì)活化染色質(zhì)誘導(dǎo)的紅斑狼瘡樣綜合征小鼠的治療作用。檢測(cè)內(nèi)容包括MTT法檢測(cè)脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化；ELISA法檢測(cè)小鼠血清中總IgG、抗dsDNA抗體、抗ssDNA抗體、抗組蛋白抗體水平；硝酸還原酶法檢測(cè)血清NO的水平；用ELISA法測(cè)定脾淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清中IFN-γ的水平，LPS誘導(dǎo)腹腔巨噬細(xì)胞產(chǎn)生白細(xì)胞介素-10(IL-10)的水平。考馬斯亮藍(lán)法檢測(cè)小鼠尿蛋白；光鏡下觀察藥物對(duì)腎臟病理改變的影響。 大鼠右后足足跖皮內(nèi)注射0.1ml完全福氏佐劑誘發(fā)佐劑性關(guān)節(jié)炎。醋酸潑尼松(Prednisone 10 mg·kg~(-1)·d~(-1))，雷公藤紅素(Tripterine 5、10、20 mg·kg~(-1)·d~(-1))灌胃給藥。致炎d19開始給藥，連續(xù)6天(d19—d24)；用大鼠后足測(cè)量?jī)x測(cè)大鼠后足體積，觀察雷公藤紅素對(duì)原發(fā)性和繼發(fā)性足腫以及對(duì)全身病變的影響；光鏡下觀察藥物對(duì)關(guān)節(jié)病理改變的影響。取關(guān)節(jié)炎大鼠腹腔巨噬細(xì)胞，采用離體實(shí)驗(yàn)觀察雷公藤紅素的作用機(jī)制：化學(xué)法測(cè)定對(duì)巨噬細(xì)胞NO釋放水平的影響、反轉(zhuǎn)錄測(cè)定對(duì)巨噬細(xì)胞白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)和TNF-αmRNA表達(dá)水平的影響，ELISA法測(cè)定對(duì)巨噬細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB水平的影響。 結(jié)果： (一)SLE樣小鼠模型的誘導(dǎo)和特征 在免疫后d45和d60活性染色質(zhì)免疫小鼠的IgG類抗dsDNA、抗ssDNA、抗組蛋白抗體和總IgG均明顯升高(P＜0.05)。血清抗核抗體核型主要為均質(zhì)型和胞漿型。而正常小鼠和正常染色質(zhì)免疫小鼠，未見抗核抗體水平的明顯升高。 與正常小鼠和正常染色質(zhì)免疫小鼠相比，在免疫后d45和d60，活性染色質(zhì)免疫小鼠的脾淋巴細(xì)胞在未加致裂原時(shí)，細(xì)胞增殖明顯，而用ConA及LPS刺激后細(xì)胞增殖水平下降，有免疫失常的表現(xiàn)。 活性染色質(zhì)免疫小鼠血清NO水平在免疫后d45(P＜0.05)和d60(P＜0.01)升高。與正常小鼠比較，正常染色質(zhì)組和活性染色質(zhì)組小鼠脾淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清中IFN-γ水平和腹腔巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清以及血清中TNF-α水平均有一定的降低，但活性染色質(zhì)組的下降更為明顯。 活性染色質(zhì)組小鼠與其他兩組相比，尿中蛋白質(zhì)水平升高，腎臟有中～重度的免疫球蛋白沉積，絕大多數(shù)局限于腎小球；腎病理切片鏡檢，可見活性染色質(zhì)組小鼠有階段性或彌散性的腎小球損傷，腎小球系膜細(xì)胞的增生，基底膜增厚，輕度的單核細(xì)胞侵潤(rùn)，而與其他兩組腎病理切片正常。 此外，活性染色質(zhì)組小鼠在d60還檢測(cè)到一定的補(bǔ)體水平下降，血象中血小板明顯減少(P＜0.05)。 (二)雷公藤紅素對(duì)SLE樣小鼠模型的治療作用 雷公藤紅素對(duì)SLE樣小鼠模型的抗自身抗體爭(zhēng)總IgG水平的影響 溶劑對(duì)照模型組與正常對(duì)照和正常染色質(zhì)組相比，抗自身抗體和總IgG明顯升高(P＜0.001，P＜0.05)。與溶劑對(duì)照模型組相比，雷公藤紅素(6、12mg·kg~(-1)·d~(-1))和醋酸潑尼松(5 mg·kg~(-1)·d~(-1))明顯抑制三種抗自身抗體和總IgG的升高(P＜0.001、P＜0.01，)。與醋酸潑尼松相比，雷公藤紅素12 mg·kg~(-1)·d~(-1)降低抗-ssDNA(p=0.027)、抗組蛋白(p=0.033)抗體作用更強(qiáng) 雷公藤紅素對(duì)SLE樣小鼠模型脾淋巴細(xì)胞增殖的影響 在沒有致裂原刺激的情況下，溶劑模型對(duì)照組的脾淋巴細(xì)胞增殖水平明顯高于正常對(duì)照和正常染色質(zhì)對(duì)照組(p＜0.001)，但致裂原刺激后溶劑模型對(duì)照組的脾淋巴細(xì)胞增殖水平與兩個(gè)對(duì)照組相比明顯處于低水平(p＜0.001)。 與溶劑模型對(duì)照組比較，雷公藤紅素12 mg·kg~(-1)·d~(-1)可明顯改善模型動(dòng)物受ConA和LPS刺激后低水平的增殖(p＜0.05)，但對(duì)未加致裂原刺激的脾細(xì)胞增殖影響不明顯。雷公藤紅素6 mg·kg~(-1)·d~(-1)對(duì)脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化的影響不明顯。 雷公藤紅素對(duì)SLE樣小鼠模型白細(xì)胞介素-10(IL-10)和干擾素-γ(IFN-γ)產(chǎn)生的影響 與正常組和正常染色質(zhì)組比較，溶劑模型對(duì)照組的腹腔巨噬細(xì)胞產(chǎn)生IL-10水平升高，而脾細(xì)胞培養(yǎng)上清中IFN-γ水平降低(p＜0.001，p＜0.05)。 與溶劑模型對(duì)照組比較，雷公藤紅素6、12 mg·kg~(-1)·d~(-1)抑制IL-10的產(chǎn)生(p＜0.001)，但對(duì)脾細(xì)胞培養(yǎng)上清中IFN-γ的水平無(wú)作用。 雷公藤紅素對(duì)SLE樣小鼠模型尿蛋白和血清NO水平的影響 與正常組和正常染色質(zhì)組比較，溶劑模型對(duì)照組有較高水平的蛋白尿(p＜0.001)。與溶劑模型對(duì)照組相比，雷公藤紅素12 mg·kg~(-1)·d~(-1)可降低蛋白尿水平(p＜0.05)。雷公藤紅素6 mg·kg~(-1)·d~(-1)醋酸潑尼松(5 mg·kg~(-1)·d~(-1))可在一定程度上降低蛋白尿水平，但沒有統(tǒng)計(jì)上的顯著性。 與正常組和正常染色質(zhì)組比較，溶劑模型對(duì)照組血清NO水平明顯升高(p＜0.001)，雷公藤紅素12 mg·kg~(-1)·d~(-1)降低升高的血清NO水平(p＜0.001)。雷公藤紅素6 mg·kg~(-1)·d~(-1)對(duì)血清NO水平無(wú)明顯的影響。 雷公藤紅素對(duì)SLE樣小鼠模型腎損害的影響 溶劑模型對(duì)照組顯示有節(jié)段性或彌散性的腎損害(n=6)，腎損害的特點(diǎn)是明顯的腎小球系膜細(xì)胞增生，腎小球毛細(xì)血管輕度單核細(xì)胞侵潤(rùn)。此類改變?cè)谡＝M和正常染色質(zhì)組未見。雷公藤紅素12 mg·kg~(-1)·d~(-1)明顯改善腎損害(p＜0.01)，雷公藤紅素6 mg·kg~(-1)·d~(-1)雖有一定的改善作用，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 (三)雷公藤紅素對(duì)大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎的治療作用及作用機(jī)制的研究 雷公藤紅素對(duì)大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎的治療作用 佐劑性關(guān)節(jié)炎發(fā)病后開始給藥，連續(xù)6天(d19—d24)，雷公藤紅素5、10、20 mg·kg~(-1)·d~(-1)可明顯抑制進(jìn)展中的原發(fā)性和繼發(fā)性關(guān)節(jié)炎、抑制全身炎癥反應(yīng)。雷公藤紅素大劑量(20 mg·kg~(-1)·d~(-1))，治療效果更為明顯，并在停藥4天內(nèi)未見明顯反跳。X-線片和病理切片顯示雷公藤紅素20 mg·kg~(-1)·d~(-1)明顯改善關(guān)節(jié)損傷和組織腫脹(P＜0.05)。 雷公藤紅素對(duì)佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠腹腔巨噬細(xì)胞的作用(離體研究) 離體研究表明，雷公藤紅素(0.1μg／ml～1μg／ml)能降低佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠腹腔巨噬細(xì)胞LPS刺激后的一氧化氮(P＜0.01)釋放水平，降低其白介素-1β(IL-1β)(P＜0.01)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)(P＜0.05)的mRNA表達(dá)水平，降低巨噬細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB水平(0.01μg／ml～1μg／ml，P＜0.01)。Hoechst熒光染色結(jié)果顯示，雷公藤紅素＞0.1μg／ml誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞凋亡。 結(jié)論：活性染色質(zhì)可同系誘發(fā)BALB／c小鼠的狼瘡樣綜合征，其癥狀與臨床SLE類似。雷公藤紅素和醋酸潑尼松對(duì)紅斑狼瘡樣綜合征有治療作用�；钚匀旧|(zhì)誘導(dǎo)建立的SLE樣綜合征小鼠模型可用于相關(guān)藥物作用機(jī)制的研究。研究結(jié)果顯示雷公藤紅素對(duì)佐劑性關(guān)節(jié)炎有治療作用。雷公藤紅素從分子水平上抑制佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠腹腔巨噬細(xì)胞的活性，并有可能通過以上途徑發(fā)揮其對(duì)佐劑性關(guān)節(jié)炎的治療作用。雷公藤紅素對(duì)兩種不同的自身免疫性疾病模型均具有抗炎免疫抑制作用。
【學(xué)位授予單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2006
【分類號(hào)】：R-332;R285

【引證文獻(xiàn)】

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1 姚重華;蘇勵(lì);覃光輝;;中藥治療狼瘡性腎炎的實(shí)驗(yàn)研究近況[J];遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào);2009年02期

本文編號(hào)：2552157