發(fā)布時間：2019-10-21 18:54

【摘要】： 肺表面活性物質(Pulmonary Surfactant，PS)是一種主要由磷脂和特異性蛋白質組成的脂蛋白復合物。PS的缺乏可引起呼吸窘迫綜合癥，特別在早產兒，發(fā)病率和死亡率都很高。自1980年PS首次被臨床應用后，許多國家競相研制PS新藥。迄今已研制出10多種藥物。根據(jù)來源不同，將PS藥物分為4類：1．天然型PS(Natural Pulmonary Surfactant)從動物肺或人羊水中提取。主要從豬肺和小牛肺灌洗液或肺勻漿中制備。2．改進的天然型PS(Modified Natural PulmonarySurfactant)：在天然型PS中補充適當比例的某些PS主要成分，如二棕櫚酰卵磷脂(Dipalmitoyllecithin，DPPC)和磷脂酰甘油(Phosphatidyl glycerol，PG)。使天然型藥物更加有效。3．人工型PS(Artificial or Synthetic Pulmonary Surfactant)：由幾種人工合成的PS主要磷脂成分或其它代用品按一定比例配制而成其主要特點是不含PS蛋白質。4．合成的“天然”型PS(Synthetic″Natural″Pulmonary Surfactant)：由人工合成的PS主要磷脂成分加一定比例的用基因工程生產的PS蛋自質配制而成。我國市場上僅有兩種肺表面活性物質制劑被批準上市銷售，一是意大利凱西制藥公司生產的固爾蘇(Curosurf)，劑型為混懸劑，價格昂貴，每支售價為4500元。另外一種是首都兒科研究所與雙鶴藥業(yè)公司合作開發(fā)的注射用牛肺表面活性劑，劑型為凍干粉，于2005年11月取得國家藥檢局的新藥證書，每支售價為3750元。本文研究的人源性肺表面活性物質(Hominine PulmonarySurfactant，HPS)從矽肺病人雙肺大容量灌洗液中提取，是一種全新的PS產品。目前國內外尚未見相關報道。 我們在北戴河煤礦工人療養(yǎng)院，對廢棄的肺灌洗液鑒定了PS和人肺表面活性物質相關蛋白A(Hominine Pulmonary Surfatcant-associated Protein A，SP-A)水平。確定有利用價值后，優(yōu)選了提取和純化的條件，并利用這些條件提純了PS和SP-A，進行了體外活性實驗和化學成份分析。對比前人，我們的PS和SP-A來自于人體肺灌洗液，有人源性的優(yōu)勢。同時在技術上利用透析方法簡化實驗勞動，利用層析純化的方式純化PS和SP-A，都是目前為止沒有報道過的創(chuàng)新之處，希望對未來患病的新生兒帶來福祉。最后對矽肺病人肺內PS水平進行了測定，對大容量灌洗后肺內PS水平不同時間段恢復情況進行了測定，希望可以造福于值得我們尊敬和熱愛的煤礦工人們。 第一部分矽肺病人雙肺大容量灌洗液的鑒定 目的 了解矽肺病人大容量肺灌洗液中提取PS是否可行。 方法 矽肺病人大容量全肺灌洗：手術室誘導麻醉，支氣管雙腔導管插管；純氧通氣，分隔兩肺，支氣管套囊注氣3ml；單肺通氣，送檢血氣分析，監(jiān)測血壓、心電圖、PaO2；左肺灌洗，0.9％氯化鈉灌洗液500ml／次，連續(xù)8-16次。采用Carlens管；觀察情況，一般情況好的(血壓、心電圖、PaO_2穩(wěn)定)行右肺灌沈。方法同前。不穩(wěn)定的擇期再灌洗右肺。(2-3天后) 鑒定肺灌洗液：顯微鏡檢12例灌洗液細胞成分比例，Ⅰ期和Ⅱ期病人各6例。灌洗液在4℃、1500×g離心15min，上清液在4℃、13000×g離心60min，收集所得的乳白色沉淀，即為HPS粗品，共收集12人次，Ⅰ期和Ⅱ期病人各6例。 ELISA方法鑒定PS含量：兩組矽肺病人分Ⅰ、Ⅱ期各6人次�？兹妇G直接顯色法檢測無機磷含量，間接推測磷脂含量。SP-A單抗B6B4E9H4D做40ug／ml稀釋，包被板條，4℃過夜，10％小牛血清封閉過夜，加入上述提取的樣品SP-A，加入酶標抗體，37℃孵育1h，PBS洗板條，顯色，判定結果。 結果 本實驗Ⅰ期和Ⅱ期病人可提取粗品磷脂分別是每人次222.92±26.04mg和121.31±29.62mg，Ⅰ期多于Ⅱ期病人。兩組SP-A分別是每人次提取87.21±17.23mg和56.97±13.44 mg，也是Ⅰ期多于Ⅱ期病人。兩組比較P分別為0.000和0.007，有統(tǒng)計學意義。 顯微鏡檢Ⅰ期和Ⅱ期病人肺灌洗液中細胞成分和比例，Ⅰ期病人肺灌洗液中嗜中性粒細胞占有核細胞總數(shù)的64.04±10.35％，顯著多于Ⅱ期病人。Ⅱ期病人有核細胞中巨噬細胞占59.76±12.78％，顯著多于Ⅰ期病人。兩組比較P分別為0.001和0.000，巨噬細胞和嗜中性粒細胞占有核細胞總數(shù)的比例差異有統(tǒng)計學意義。 結論 在早期矽肺病人大容量肺灌洗液中提取PS是可行的。在Ⅰ期病人肺內嗜中性粒細胞較多，Ⅱ期巨噬細胞較多。相信在各自的期別具有各自介導炎性反應的途徑。 第二部分正交實驗設計優(yōu)選大容量矽肺病人灌洗液粗提PS的條件 目的 篩選從矽肺病人雙肺大容量灌洗(Whole-Lung Lavage，WLL)回收液體中粗提人源性肺泡表面活性物質(Hominine Pulmonary Surfactant，HPS)的方法。 方法 以HPS的獲得量為指標，采用正交實驗設計。一個人的雙肺灌洗回收液均分9份。篩選不同初離心條件、不同孔徑透析袋濃縮、不同高速離心條件和不同化學試劑萃取，共9次實驗。 結果 以初離心：3000g，15min；3KD孔徑透析袋濃縮；高速離心條件10000g，15min；化學試劑正丁醇萃取為最佳條件。利用該條件從6人單肺灌洗液(共72000ml)中提取了PS粗品7968.6222mg。 結論 該方法克服了矽肺病人肺灌洗液大容量和吸入金屬物極多的問題，可以用來粗提HPS。 第三部分凝膠色譜提純HPS 目的 利用凝膠色譜提純HPS粗品。 方法 摸索提純HPS條件，制備SEPHROSE凝膠色譜柱。 結果 提取HPS色譜條件：層析柱：Sephadex LH-20凝膠層析柱(15mm×400mm)。把正丁醇萃取的粗品PS用氯仿-甲醇(1∶1／v∶v)溶解后上樣。流動相：氯仿-甲醇(1∶1／v∶v)，流速：1.0ml／min；收集220nm濾片以PC為主峰液體。將收集液旋轉蒸發(fā)，40℃，15min，乙醇洗出，超凈臺抽風吹干，得到純品HPS。水浴溫度為44℃。 純化的HPS純品12646.76 mg。 結論 本產品天然HPS純序高。實驗方法可行。 第四部分HPS化學成分分析 目的 分析和比較HPS和其他PS制劑的化學組分。 方法 1 HPS的各組分含量測定：總磷脂含量測定采用硫酸—過氯酸消化孔雀綠顯色法；蛋白質含量測定采用考馬斯亮蘭法、膽固醇和甘油三酯含量測定均按酶比色法進行操作。 2 HPS中磷脂的各組分分析：采用高效液相色譜法(High Performance Liquid Phase Chromatography，HPLC)。 3所得數(shù)據(jù)用SPSS10.0統(tǒng)計軟件進行分析。 結果 1 8例病人肺灌洗液共約192000ml。利用前述離心、透析、萃取、色譜提純的方法，8例病人總共提取12646.76mg。HPS產物中各化學成分分別為：磷脂(95.74±1.95)％，甘油三脂(1.09±0.69)％，膽固醇(1.02±0.21)％，蛋白質(2.15±1.03)％。 2 HPS的各磷脂組分的構成比為：磷脂酰膽堿PC(80.43±5.05％)、磷脂酰甘油PG(6.67±0.45％)、磷脂酰乙醇胺PE(6.78±2.02％)、磷脂酰肌醇PI(3.77±2.20％)、磷脂酰絲氨酸PSE(2.35±1.61％)。HPS中磷脂含量達到95％以上其中PC含量達到80.43％，而TC、TG、蛋白質含量均較低，磷脂酰膽堿含量較高且磷脂成分比較齊全，說明HPS中磷脂成分較齊全，符合PS制劑的要求。 3本實驗所采用的HPLC，各磷脂組分的保留時間和峰面積的重復性好、精密度高，可用來動態(tài)分析生產過程中各磷脂組分的含量，在HPS制備過程中和制備后及時分析是確保產品質量可靠性的關鍵，對提高HPS的生產質量具有重要意義。 結論 本研究制備的HPS產物中化學組分含量和磷脂組分的構成符合PS制劑標準。 第五部分親和層析提純SP-A 目的 提取矽肺病人灌洗液中的SP-A。 方法 制備親和層析柱，摸索提純SP-A的條件。利用ELISA法鑒定SP-A。利用色譜譜圖計算SP-A含量。和光度計測定的總蛋白含量對比，計算產物的純度。 結果 本方法每人次提純SP-A含量為1.3692±0.3885g。純度達到92.20±7.00％。對SP-A制備的方法和工藝過程進行了研究，確定了制備SP-A的最佳條件為：提純：制備Sepharose 4B-抗人SP-AmAbs親和層析柱：(15mm×400mm)。0.1Mol／LpH2.4甘氨酸—HCl緩沖液，流速1ml／min，收集解吸附下來的成分，沈出液OD_(280)＜0.02為止。立即以1Mol／LNaHCO_3中和到pH7.0，以免蛋白變性。 結論 萃取、透析和色譜分離的方法在大容量肺灌洗液體提取SP-A可行。用萃取、透析和色譜分離的方法能較好地提純肺表面活性物質蛋白A。 第六部分肺表面活性物質的體外活性測定 目的 了解HPS的表面活件特征和加入SP-A后的效果。 方法 1采用JM04動態(tài)膜壓記錄儀測定HPS的表面活性特征。 2所得數(shù)據(jù)用SPSS10.0統(tǒng)計軟件進行分析。 結果 測得代表HPS降低表面張力和膜穩(wěn)定性的指標如下：蒸餾水表面張力改變的數(shù)量，壓縮80％再張開到原有面積，由原先的14.16±2.07mN／m變化到1.13mN／m，變化幅度達到13.04±0.40mN／m。加入HPS 50ul后，由21.38±2.20mN／m降低到0.74±0.08mN／m，變化幅度達到20.64 mN／m。較大地改變了膜表面張力。給蒸餾水加入HPS+SP-A后，表面張力在膜表面積壓縮和張開過程中，由25.67±2.91mN／m降低到0.51±0.17mN／m，降低幅度達到25.16mN／m。較前明顯改變了膜表面張力。三組數(shù)據(jù)方差分析顯示組間均數(shù)均有差異，P為0.000，差異有統(tǒng)計學意義。 結論 本方法提純的HPS純品具有改變蒸餾水表面張力作用，在膜壓縮過程中保持穩(wěn)定性。加入SP-A，在蒸餾水表面膜壓縮過程中，降低表面張力的作用優(yōu)于單純HPS制品。提示SP-A優(yōu)化了HPS在蒸餾水表面的分布，進一步降低了膜表面張力。因此，本法提取的HPS和SP-A可用于人與動物實驗和臨床替代治療的應用和研究。 HPS制劑加入蒸餾水后可有效降低表面張力，具備PS的表面活性特征。SP-A可以協(xié)助HPS進一步降低表面張力。 第七部分矽肺病人和肺泡蛋白沉積癥一例肺灌洗液HPS水平比較 目的 側證矽肺病人不同時期HPS水平變化。 方法 利用前述提取HPS和SP-A方法，提取矽肺病人24人(灌洗液12000ml／人)和肺泡蛋白沉積癥一例肺灌洗液(27000m1)中HPS和SP-A并比較之。 結果 該PAP病人肺內HPS、蛋白質、SP-A的水平均較Ⅰ期矽肺病人高2-3倍之多。達到HPS 287.4mg／l，Protein 4.42g／l，SP-A 2.89g。Ⅰ期矽肺病人各項數(shù)據(jù)分另4是HPS 137.13±17.40mg／l，Protein 1.62±0.45 g／l，，SP-A 0.95±0.20g。相對而言，矽肺病人肺內堆積的表面活性物質含量不足該例PAP病人的30％。Ⅱ期HPS32.6±3.89 mg／l，Protein0.98±0.39g／l，SP-A0.61±0.16g，Ⅲ期HPS29.9±6.43mg／l，Protein 0.43±0.11g／l，SP-A 0.52g±0.23g。矽肺病人肺內堆積的表面活性物質逐期下降。三期數(shù)據(jù)方差分析顯示組間均數(shù)均有差異，P為0.000，差異有統(tǒng)計學意義。 結論 矽肺發(fā)病初期，表面活性物質大量堆積。但是數(shù)量僅為該PAP病人肺泡內表面活性物質堆積數(shù)量的30％。隨期別增加，肺內堆積的表面活性物質水平下降。 第八部分大容量肺灌洗后肺內PS恢復情況 目的 了解全肺大容量灌洗術術后肺內HPS水平變化。 方法 給矽肺病人行全肺大容量灌洗，鑒定術后不同時間肺內洗出液體的HPS濃度，了解術后HPS的變化。間接反映肺泡Ⅱ型細胞代償性分泌HPS增加的情況。 結果 三個時間段的數(shù)據(jù)方差分析顯示組間均數(shù)均有差異，P為0.000，差異有統(tǒng)計學意義。提示三期病人三個時間段比較都有恢復。 Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期矽肺病人肺內PS水平分別在263.4±20.37mg／l、183.8±19.34mg／l、77.7±01.94mg／l。以此為基礎，沒有繼續(xù)灌洗(丟失)，Ⅰ期矽肺病人術后10分鐘檢測肺內PS水平即達到460.4±22.03mg／l，30分鐘達到842.8±34.17mg／l，P為0.000。Ⅱ期矽肺病人術后10分鐘檢測肺內PS水平達到191.2±18.9mg／l，術后30分鐘達到425.8±20.04mg／l，與術后即時水平比較P均為0.000。Ⅲ期矽肺病人術后30分鐘檢測肺內PS水平達到81.5±03.40mg／l，與術后即時77.7±01.94mg／1的水平比較P為0.000，雖有統(tǒng)計學意義，表明出現(xiàn)代償，但是總體水平仍然高出不多，不能明顯改善病人灌洗后呼吸困難的情況，不能起到多少實際效果。 結論 灌洗可以引起PS丟失。但I期矽肺病人灌洗后可以在很短時間(＜10min)出現(xiàn)代償并恢復肺內PS水平。Ⅱ期矽肺病人PS丟失，10min左右還沒有出現(xiàn)明顯代償情況。大約30min出現(xiàn)代償并恢復肺內PS水平。Ⅲ期矽肺病人術后30分鐘出現(xiàn)了代償?shù)珶o實際意義。 小結 1本研究運用ELISA方法和離心方法初步驗證了大容量肺灌洗液中含有高水平的HPS、SP-A。 2本研究優(yōu)選了透析、化學萃取和離心的最佳條件為：以初離心：3000g，15min；3KD孔徑透析袋濃縮，高速離心條件10000g，15min；化學試劑正丁醇為最佳條件。利用該條件從6人次單肺灌洗液(各12000 ml)中提取了PS粗品7968.6222mg。 3本研究利用透析、化學萃取、色譜提純方法分離提取HPS，獲得提純的HPS12646.76 mg。對HPS純品制備的方法和工藝過程進行了研究，確定了制備HPS的最佳條件為：提純：層析柱：Sephadex LH-20凝膠層析柱(15mm×400mm)。把正丁醇萃取的粗品PS用氯仿-甲醇(1∶1／v∶v)溶解后上樣。流動相：氯仿-甲醇(1∶1／v∶v)，流速：1.0ml／min；收集220nm濾片以PC為主峰的液體，將收集液旋轉蒸發(fā)，44℃，15min。乙醇洗出，超凈臺抽風吹干，得到純品PS，水浴溫度44℃。 4本研究分析了HPS制劑的化學組分和磷脂的各組分。8例病人肺灌洗液共約192000ml。利用離心、透析、萃取、色譜提純的方法，8例病人總共提取12646.76mg。人均提取HPS為1580.85mg。HPS產物中各化學成分分別為：磷脂(95.74±1.95)％，甘油三脂(1.09±0.69)％，膽固醇(1.02±0.21)％，蛋白質(2.15±1.03)％。 HPS的各磷脂組分的構成比為：磷脂酰膽堿PC(80.43±5.05％)、磷脂酰甘油PG(6.67±0.45％)、磷脂酰乙醇胺PE(6.78±2.02％)、磷脂酰肌醇PI(3.77±2.20％)、磷脂酰絲氨酸PSE(2.35±1.61％)。HPS中磷脂含量達到95％以上，其中PC含量達到80.43％，而TC、TG、蛋白質含量均較低，磷脂酰膽堿含量較高且磷脂成分比較齊全，說明HPS中磷脂成分較符合人體需要。 5本研究利用色譜提純方法分離提取SP-A。對SP-A制備的方法和工藝過程進行了研究，確定了制備SP-A的最佳條件為：提純：制備Sepharose 4B-抗人SP-AmAbs親和層析柱：(15mm×400mm)。0.1Mol／L pH2.4甘氨酸—HCl緩沖液，流速1ml／min，收集解吸附下來的成分，洗出液OD_(280)＜0.02為止。立即以1Mol／L NaHCO3中和到pH7.0，以免蛋白變性。本方法每人次提純SP-A含量為1.3692±0.3885g。純度達到92.20±7.00％。萃取、透析和色譜分離的方法在大容量肺灌洗液體提取SP-A可行。用萃取、透析和色譜分離的方法能較好地提純肺表面活性物質蛋白A。 6測得代表HPS降低表面張力和膜穩(wěn)定性的指標如下：蒸餾水表面張力改變的數(shù)量，壓縮80％再張開到原有面積，由原先的14.16±2.07mN／m變化到1.13±0.40mN／m，變化幅度達到13.03mN／m。加入HPS 50ul后，由21.38±2.20mN／m降低到0.74±0.08mN／m，變化幅度達到20.64 mN／m。較大地改變了膜表面張力。給蒸餾水加入HPS+SP-A后，表面張力在膜表面積壓縮和張開過程中，由25.67±2.91mN／m降低到0.51±0.17mN／m，降低幅度達到25.16mN／m。較前明顯改變了膜表面張力。本方法提純的HPS純品加入蒸餾水后可有效降低表面張力，具備PS的表面活性特征。SP-A可以協(xié)助PS進一步降低表面張力。 7本文比較了矽肺病人和肺泡蛋白沉積癥的患者HPS、SP-A水平。該PAP病人肺內HPS、蛋白質、SP-A的水平均較Ⅰ期矽肺病人高2-3倍之多。達到HPS287.4mg／l，Protein 4.42g／l，SP-A 2.89g。Ⅰ期矽肺病人各項數(shù)據(jù)分別是HPS137.13±17.40 mg／l，Protein 1.62±0.45 g／l，SP-A 0.95±0.20g。相目對而言，矽肺病人肺內堆積的表面活性物質含量不足該例PAP病人的30％。Ⅱ期HPS32.6±3.89mg／l，Protein 0.98±0.39g／l，SP-A0.61±0.16g，Ⅲ期HPS29.9±6.43mg／l，Protein 0.43±0.11g／l，SP-A 0.52g±0.23g。矽肺病人肺內堆積的表面活性物質逐期下降。 矽肺發(fā)病初期，表面活性物質堆積。但是數(shù)量僅為PAP病人肺泡內表面活性物質堆積數(shù)量的30％。隨期別增加，各種物質含量持續(xù)下降。 8三期病人術后三個時間段(0、10、30min)比較PS水平都有恢復。Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期矽肺病人肺內PS水平分別在263.4±20.37mg／l、183.8±19.34mg／l、77.7±01.94mg／l。以此為基礎，沒有繼續(xù)灌洗(丟失)，Ⅰ期矽肺病人術后10分鐘檢測肺內PS水平即達到460.4±22.03mg／l，30分鐘達到842.8±34.17mg／l，P為0.000。Ⅱ期矽肺病人術后10分鐘檢測肺內PS水平達到191.2±18.9mg／l，術后30分鐘達到425.8±20.04mg／l，與術后即時水平比較P均為0.000。Ⅲ期矽肺病人術后30分鐘檢測肺內PS水平達到81.5±03.40mg／l，與術后即時77.7±01.94mg／1的水平比較P為0.000，雖有統(tǒng)計學意義，表明出現(xiàn)代償，但是總體水平仍然高出不多，不能明顯改善病人灌洗后呼吸困難的情況，不能起到多少實際效果。 灌洗可以引起PS丟失，但Ⅰ期矽肺病人灌洗后可以在很短時間(＜10min)出現(xiàn)代償并恢復肺內PS水平。Ⅱ期矽肺病人PS丟失，10min左右還沒有出現(xiàn)明顯代償情況。大約30min出現(xiàn)代償并恢復腫內PS水平。Ⅲ期矽肺病人術后30分鐘出現(xiàn)了代償?shù)珶o實際意義。
【圖文】：

6398士9134.22士6.5864.04士6485士6759.76士12.7826.81士1.8934.3528.190.0880.0010.00沉淀顯微鏡檢見圖1一1、圖1一2論矽肺機理研究已有較大的進展，矽塵進入肺泡后，以炎性細胞為分泌的趨化因子、氧自由基和細胞因子，導致肺泡炎和纖維化。質是磷脂與表面活性蛋白共同組成復合物，SP一A是4種表面活性蛋表面活性物質由n型肺泡上皮細胞合成和分泌，對維持肺的正常的生理學意義。動物實驗表明，矽塵可引起SP一A增加，伴有肺H型協(xié)一護

第三部分凝膠色譜純化PS洗脫流速應根據(jù)情況而定，最大流速約5耐/min，建議流速為2ml/min。較低的流速，具有較高的分辯率。按0D二〔，出峰收集所要的磷脂。1.2.6再生凝膠再生通常是先用2一3個柱體積的洗脫液進行清洗。2結果8例病人肺灌洗液共約192000ml。利用前述離心、透析、萃取、色譜提純的方法，析見下圖8例病人總共提取HPS純品12646.76mg。粗品、純品色譜譜圖對照分
【學位授予單位】：第一軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2007
【分類號】：R341

【引證文獻】

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1 劉紅梅;涂健;潘玲;祁克宗;;豬親水性肺表面活性蛋白及其天然免疫機制[J];中國預防獸醫(yī)學報;2012年06期

本文編號：2551486