【摘要】： 目的:1.構建表達結(jié)核分枝桿菌分泌蛋白Ag85B的靶細胞,應用于CTL殺傷實驗以評定結(jié)核疫苗的免疫效果。2.觀察及監(jiān)測有機硒與卡介苗聯(lián)合運用于小鼠的安全性、臟器荷菌量,及誘導小鼠產(chǎn)生的特異性細胞免疫應答。3.從體外細胞水平探討有機硒對受BCG感染后的巨噬細胞產(chǎn)生NO的能力、生存能力和處理細菌能力的影響。 方法: 1.將攜帶有Ag85B基因的重組質(zhì)粒pTB30s轉(zhuǎn)入小鼠骨髓瘤細胞(SP2/0),用RT-PCR及免疫組化染色法鑒定陽性克隆細胞內(nèi)的Ag85B基因轉(zhuǎn)錄和蛋白表達水平,并以此陽性細胞作為CTL的靶細胞,用MTT法檢測各組小鼠針對Ag85B的特異性CTL殺傷活性。 2.將C57BL/6小鼠分為4組:A組BCG皮內(nèi)接種+喂硒、B組BCG皮內(nèi)接種、C組單純喂硒、D組對照組。免疫后觀察小鼠飲水量和體重變化,于接種4周、8周后通過觀察胸腺、脾指數(shù)及脾、肺的細菌數(shù)來評價BCG與有機硒聯(lián)合應用的安全性及BCG的定植能力;通過檢測淋巴細胞增殖指數(shù)SI、IL-2、IFN-γ、CTL殺傷活力、顆粒酶B及穿孔素的表達量來評價機體抗結(jié)核的細胞免疫能力。 3.使用Griess法、MTT法、Ziehl-heelson染色法及活菌計數(shù)法,通過檢測各實驗組小鼠腹腔巨噬細胞和巨噬細胞系Raw264.7細胞在不同硒濃度的培養(yǎng)液內(nèi)感染BCG后的NO釋放水平、細胞的存活率和載菌量來分析硒對巨噬細胞抗結(jié)核菌天然防御作用的影響。 結(jié)果: 1. RT-PCR以及免疫組化結(jié)果顯示,陽性細胞能穩(wěn)定表達Ag85B。 2. BCG+Se組和BCG組小鼠飲水量、體重無顯著性差別;BCG+Se組免疫4周、8周的脾指數(shù)、脾肺荷菌量和4周胸腺指數(shù)略高于BCG組,差異不顯著;BCG+Se組的SI、IL-2、IFN-γ、CTL殺傷活力,免疫4周、8周后均顯著高于BCG組,差異有顯著性意義(P0.05。) 3.含硒感染孔的NO產(chǎn)量顯著性高于無硒感染孔: BCG+ Se組以25ng/ml～100 ng/ml含硒孔NO增高顯著(P0.05);含硒感染孔的Mφ成活率均高于無硒感染孔,P0.05;含硒孔荷菌量均低于無硒孔,但吞菌4h的活菌計數(shù)的結(jié)果卻恰恰相反。 結(jié)論: 1.含有Ag85B靶細胞的成功構建及應用,為評價結(jié)核疫苗的免疫效果提供了較好的研究手段。 2. BCG與有機硒聯(lián)合使用并未有可見的毒副反應,安全可行;BCG與有機硒有免疫協(xié)同作用,能誘導機體產(chǎn)生較強的抗結(jié)核的細胞免疫應答。 3.有機硒對Mφ的抗結(jié)核天然防御免疫功能有促進作用,且有劑量依賴關系。同時,硒對巨噬細胞有應激保護作用。
【圖文】：

0s及對照組的針對Ag85B的特異性CTL殺傷作：RT-PCR 試劑盒、限制性內(nèi)切酶 EcoRⅠ、Hg85B 上游引物、下游引物（P1、P2）[1]由同贈。小鼠 actin 上游引物 P3：5′-GGGAAT GG P4：5′-AGA AGG AAG GCT GGA AAA GA pTB30s 由范雄林教授惠贈。由 5.4kb 雙鏈環(huán)氨芐青霉素和新霉素抗性,圖 1)與 880bpAg85B

比例（預實驗 100：1、 25：1刺激的實驗孔，，同時設靶細胞對束前 4h 加入 5mg/ml MTT10μ，A570 測定 A 值，計算殺傷率驗孔 A 值－效應細胞對照孔 為 2.605μg/μl，A260/A280 為 圖 2 所示：可觀察到一條 880約 5.4kb 大小的條帶，與第一泳1 2 M
【學位授予單位】：重慶醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2007
【分類號】：R392

【參考文獻】

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本文編號：2548221