【摘要】：變態(tài)反應(yīng)性疾病特別是哮喘是危害嚴(yán)重的全球性公共衛(wèi)生問(wèn)題,在大多數(shù)國(guó)家,哮喘的發(fā)病率及死亡率呈持續(xù)上升趨勢(shì)。塵螨變應(yīng)原是引起變態(tài)反應(yīng)性疾病的重要病因之一,特別是引起兒童變應(yīng)性哮喘的重要危險(xiǎn)因子。變應(yīng)性疾病的病因復(fù)雜,除了復(fù)合多基因式遺傳外,出生前后與環(huán)境變應(yīng)原的接觸也至關(guān)重要。鑒于此,WHO提出兒童變應(yīng)性疾病的三級(jí)預(yù)防理論并呼吁一級(jí)預(yù)防應(yīng)成為今后研究的重點(diǎn)。多項(xiàng)研究表明孕期母體高水平的變應(yīng)原特異IgG抗體對(duì)胎兒今后發(fā)生變應(yīng)性疾病具有抑制作用。因此,本課題擬制備塵螨變應(yīng)原特異的人源抗體IgG Fab片段用于螨性變應(yīng)性疾病的防治研究。 首先分離接受塵螨注射液脫敏治療并證實(shí)具有高水平抗塵螨IgG的變應(yīng)性哮喘患者的外周血淋巴細(xì)胞,提取總RNA,構(gòu)建非依賴性克隆滴度為8×108的抗塵螨變應(yīng)原的IgG抗體庫(kù)；同時(shí)分離近兩個(gè)月內(nèi)未曾患感冒等感染性疾病的300名健康志愿者的外周血淋巴細(xì)胞,同法構(gòu)建非依賴性克隆滴度為9×108的人IgG抗體庫(kù)。以實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)的粉塵螨制備粉塵螨螨體浸出液、代謝培養(yǎng)基浸出液并利用基因工程手段制備重組2類變應(yīng)原rDer f 2。分別以上述天然粗抗原及重組變應(yīng)原作為抗原,采用克隆印跡法和ELISA法對(duì)抗體庫(kù)進(jìn)行多輪篩選,共篩選克隆數(shù)約為1.8×106個(gè),經(jīng)反復(fù)驗(yàn)證,最終獲得兩個(gè)可與塵螨變應(yīng)原特異性結(jié)合的陽(yáng)性克隆,命名為AM1和AM2,序列比較的結(jié)果顯示兩個(gè)克隆的重鏈?zhǔn)峭耆吹�。�?yáng)性克隆AM1的輕鏈與抗塵螨變應(yīng)原的重鏈庫(kù)重組,構(gòu)成重鏈更替的抗體庫(kù),以重組的Der f 2作為抗原,經(jīng)克隆印跡法篩選,獲得1個(gè)親和力提高的特異性陽(yáng)性克隆AM1L-Hsh。AM1的輕鏈可變區(qū)近似系為K2-30,基因同源性為87%；重鏈可變區(qū)近似系為VH3-30,基因同源性為96%；AM2的輕鏈可變區(qū)近似系為K3-27,基因同源性為95%；AM1L-Hsh的重鏈可變區(qū)近似系為VH5-1。對(duì)上述3個(gè)Fab片段進(jìn)行大量表達(dá),并以金屬螯合親和層析法進(jìn)行純化,表面等離子共振BIAcore檢測(cè)顯示均有較高的親和力,解離常數(shù)在1.27×10-9-6.3×10-8之間,鏈替換改造后親和力有8倍提高。ELSIA、斑點(diǎn)印跡等檢測(cè)證實(shí)純化的抗體可特異性識(shí)別重組2類變應(yīng)原及天然粗抗原。肥大細(xì)胞脫顆粒抑制試驗(yàn)顯示塵螨變應(yīng)原特異的IgG Fab片段可顯著抑制肥大細(xì)胞的脫顆粒反應(yīng),提示Fab片段具有競(jìng)爭(zhēng)性抑制抗原結(jié)合的作用。 塵螨變應(yīng)原特異的重組人單抗IgG Fab片段的制備和研究工作,為進(jìn)一步應(yīng)用變應(yīng)原特異的IgG抗體預(yù)防和治療螨性變應(yīng)性哮喘提供了理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù),至今尚未見(jiàn)國(guó)內(nèi)外相關(guān)研究報(bào)道。
【圖文】：

2.1PCR反應(yīng)擴(kuò)增 DerfZ基因采用引物 DerfZ一S一 Nde/DerfZ一AS一Xho，從粉塵蝸cDNA中經(jīng)30個(gè)循環(huán)的PCR擴(kuò)增反應(yīng)，獲得的PCR產(chǎn)物進(jìn)行2.0%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果見(jiàn)圖1一3，片段大小為4O6bp。bp1000-500-斗 DerfZ M.100bPLadderDNAMarker1.PCR擴(kuò)增產(chǎn)物圖1一3.粉塵瞞2類變應(yīng)原的PCR擴(kuò)增2.2重組質(zhì)粒pET19b一 DerfZ的構(gòu)建及酶切鑒定以從企I和腸01對(duì)重組質(zhì) 粒pET1gb一 DerfZ進(jìn)行酶切，得到大小為5717bp的表達(dá)載體pET19b和大小為406bp的目的基因片段兩個(gè)產(chǎn)物(圖1一4)，證實(shí)目的基因插入位點(diǎn)及插入片段大小均正確。重組質(zhì)粒DNA含量估計(jì)為25ng/州。bP載體 5717bP1000-500-插入片段406bPMloobpLadderDNAMarker重組質(zhì)粒的刀山I和JA火01酶切產(chǎn)物圖1一4.重組質(zhì)粒pET19b一 DerfZ的酶切鑒定第25頁(yè)共101頁(yè)

2.1PCR反應(yīng)擴(kuò)增 DerfZ基因采用引物 DerfZ一S一 Nde/DerfZ一AS一Xho，從粉塵蝸cDNA中經(jīng)30個(gè)循環(huán)的PCR擴(kuò)增反應(yīng)，獲得的PCR產(chǎn)物進(jìn)行2.0%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果見(jiàn)圖1一3，，片段大小為4O6bp。bp1000-500-斗 DerfZ M.100bPLadderDNAMarker1.PCR擴(kuò)增產(chǎn)物圖1一3.粉塵瞞2類變應(yīng)原的PCR擴(kuò)增2.2重組質(zhì)粒pET19b一 DerfZ的構(gòu)建及酶切鑒定以從企I和腸01對(duì)重組質(zhì) 粒pET1gb一 DerfZ進(jìn)行酶切，得到大小為5717bp的表達(dá)載體pET19b和大小為406bp的目的基因片段兩個(gè)產(chǎn)物(圖1一4)，證實(shí)目的基因插入位點(diǎn)及插入片段大小均正確。重組質(zhì)粒DNA含量估計(jì)為25ng/州。bP載體 5717bP1000-500-插入片段406bPMloobpLadderDNAMarker重組質(zhì)粒的刀山I和JA火01酶切產(chǎn)物圖1一4.重組質(zhì)粒pET19b一 DerfZ的酶切鑒定第25頁(yè)共101頁(yè)
【學(xué)位授予單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號(hào)】：R392.8

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前3條

1 崔玉寶;塵螨的生物學(xué)、生態(tài)學(xué)與流行概況[J];國(guó)外醫(yī)學(xué)(寄生蟲病分冊(cè));2004年06期

2 范怡敏;楊彬;邵紅霞;莊義軍;程訓(xùn)佳;;上海地區(qū)戶塵螨的分離培養(yǎng)及Der p 2基因的克隆與表達(dá)[J];現(xiàn)代免疫學(xué);2006年05期

3 于業(yè)軍;畢麗麗;劉曉萍;王東嶺;張虹;;脫敏組方抑制肥大細(xì)胞脫顆粒的實(shí)驗(yàn)研究[J];中國(guó)皮膚性病學(xué)雜志;2006年09期

本文編號(hào)：2535126